實驗動物仁慈終點及安樂死的法規現狀與思考*

史光華 李麟輝 呂龍寶 張曉迪 陳佳琦

(1. 中國合格評定國家認可中心，北京 100062)(2. 中國科學院昆明動物研究所，昆明 650223)

體現“替代、減少、優化”的3R準則是當今國際上開展動物試驗普遍遵循的動物福利原則[1]。“替代原則”指使用其他方法而不用動物進行科學研究，或使用沒有知覺的試驗材料替代以往使用神志清醒、活的脊椎動物進行試驗；“減少原則”指減少動物用量獲取同樣多的試驗數據或使用一定數量的動物獲得更多試驗數據的方法；“優化原則”指通過改進或完善實驗程序，減輕或減少給動物造成與實驗目的無關的疼痛和不安[1-2]。目前，“優化”原則主要體現在應用仁慈終點并仁慈處死動物(即安樂死)[3]。因此，國際上將仁慈終點及安樂死作為一種優化策略，用來減輕動物在實驗期間遭受的疼痛和痛苦[4]。

實際工作中如何正確實施仁慈終點及安樂死是實現“優化”原則的重要步驟。本文主要介紹國際上實驗動物仁慈終點及仁慈處死動物的相關指南、法規實踐現狀，為業界同仁及我國相關法規、標準的完善提供參考。

1 國際及區域組織

1.1 經濟合作與發展組織

經濟合作與發展組織(Organization for economic co-operation and development, OECD)于2000年發布的《應用臨床體征識別、評估安全性評價中動物實驗仁慈終點的指南》(以下簡稱指南)適用于所有毒理學動物試驗中使用的哺乳動物。指南詳細敘述了識別動物疼痛和痛苦的方法、仁慈處死動物需要依據的毒性表現及仁慈處死動物的方法[5]。優化原則在該文件中得到了明確且充分的體現，在國際范圍內具有至高的權威性[3]。

《指南》提出：仁慈處死動物需要根據動物正在承受疼痛和痛苦的程度來決定。觀察者應熟悉動物正常和異常表現，要有能力來識別動物的毒性表現。對試驗中的動物每天進行一次一般觀察，至少一周一次進行詳細檢查，出現毒性表現后可增加觀察次數。《指南》中對動物是否在承受疼痛和痛苦的觀察指標及動物正在承受疼痛和痛苦的表現進行了詳細說明。瀕死和臨近死亡的動物和正在遭受嚴重疼痛和痛苦的動物應進行安樂死。急性毒性試驗中動物健康產生快速改變、重復染毒試驗中動物毒性表現進行性加重時均應考慮是否對動物進行安樂死。

仁慈處死動物的方法即安樂死，是指處死動物時盡可能減少動物的疼痛和痛苦。《指南》主要介紹了物理學方法、注射法、吸入法、混合法等。物理學方法需要較高的技術熟練程度，魚類和兩棲類動物處死時一般選擇物理方法，體質量小于150 g的嚙齒類動物可采用頸椎脫臼法；犬、貓、豬、猴等大型動物處死時一般選擇注射法；大鼠、小鼠和其他小型嚙齒類動物一般選擇二氧化碳吸入法。

1.2 歐盟

1.2.1ETS 123：歐盟《用于實驗及其他科學目的的脊椎動物保護歐洲公約》(European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes)第5款的補充說明(Appendix A- Guidelines for accomodation and care of animals)，對動物的安樂死提出了要求：所有處死動物的人道方法均需要有一定專業技能的人員施行，而這些專業技能只能通過適當培訓獲得。處死動物所采用的方法宜遵循歐洲委員會關于實驗動物施行安死術推薦意見中規定的原則(第1部分和第2部分)。深度昏迷的動物可采用放血法處死，但在未實施麻醉的情況下，不宜使用在失去知覺前造成肌肉麻痹的藥物方法、產生箭毒樣作用的藥物方法，以及電流不通過大腦的電擊法。動物處置只有在確認動物死亡后才可施行。

1.2.2歐盟2010/63/EU：歐盟27國于2013年1月1日起實施新的保護試驗用動物指令，該法規承認目前仍需要使用動物進行試驗的現狀，并把仁慈終點提上了法律層面。新指令第1條就明確了3R原則，指出應確保優化的原則并不局限于指導科學實驗，還應運用于動物的照料、護理、飲食和繁殖過程[6]。

指令禁止動物遭受非常嚴重的疼痛和痛苦，在條款23第13條中規定“盡可能避免以死亡作為試驗終點，以更早期和仁慈的終點取代”，第15條規定“如果涉及到可能是長期的而不能緩解的劇烈疼痛、痛苦或不適，成員國應確保該項目不被執行”，并在附件八中列出了試驗程序中動物痛苦嚴重程度分類。第6條規定了強制性人道處死動物的內容，并在附件四中列出了不同實驗動物進行仁慈處死的具體指南[7]。

2 其他國家

2.1 美國

美國國家科學院發布的《實驗動物飼養管理和使用指南(第八版)》對動物仁慈終點判定及安樂死的時機、方法選擇、評價都做了詳細介紹。明確指出在某些實驗臨近實驗終點時，若動物即將遭受無法減輕的劇痛和不適、甚至是死亡時，可采用仁慈終點代替實驗終點[8]。

仁慈終點的判定需要衡量模型、動物種類、動物健康狀況、實驗目的、機構政策和法規要求等多種要素。實驗動物管理和使用人員應該熟悉動物的行為、生理、生化方面的健康特征，才可辨識不同動物對疼痛的臨床癥狀，如悲鳴、消沉、行為異常、外貌動作異常、懶怠不動等。通常情況下認為引起人類疼痛的手術也會引起動物疼痛。

實驗方案中應該包括執行安樂死的標準，比如身體或行為缺陷等級、腫瘤大小等。當實驗結束，鎮靜劑、止痛劑及其他方法無法減輕實驗動物疼痛憂慮時，才能進行安樂死。執行安樂死時藥劑和方法的選擇取決于動物種類和實驗目的。一般來說，吸入性或非吸入性安樂死藥劑優于物理安樂死(如頸椎脫臼法、斬首、穿透式擊桿法)。評價安樂死方法是否妥當，應該考慮幾方面：使動物在無痛苦、無焦慮或短暫痛苦的狀態下失去意識或死亡的能力；可靠性；不可逆性；引導動物喪失意識的時間；種類和年齡限制；與研究目標一致性；工作人員的安全以及對他們情緒的影響。

2.2 加拿大

1998年加拿大動物保護協會(CCAC)發布了《研究、教學和檢測中選擇實驗動物仁慈終點指南》，為用于生物醫學研究、教學及試驗中動物疼痛及痛苦終點的選擇進行規范，并指出動物使用的優化是一個漸進過程，需要不斷尋找更為人道的動物實驗終點將動物使用過程中其經歷的痛苦最小化[9]。

指南主要對如何確定仁慈終點進行了詳細介紹，并對嚙齒類動物單克隆抗體制備、癌癥研究、毒理學研究和毒性測試、疼痛研究、傳染病研究、疫苗試驗等研究中仁慈終點的確定給予指導意見。指南給出了選擇合適仁慈終點的推薦程序：使用評分法對動物身體狀況進行評估，所得分數意味著動物偏離正常狀態的程度，可看作為是動物疼痛和痛苦的增加。

試驗過程中的動物會隨著不適、疼痛和痛苦的程度表現出異常，因此在實驗前應熟知動物的行為特性。根據研究內容制定觀察指標對動物狀況進行評分可為仁慈終點的判定提供客觀參考，以此來建立動物疼痛評估方法。評估動物身體狀況主要有五個方面，分別為體質量變化、外部體征表現、心率和呼吸頻率等臨床指標、非誘導行為的變化及外部刺激的行為反應。除這些行為和生理指標外，兒茶酚胺、皮質激素、催乳素、腫瘤壞死因子、白細胞介素等血液生化指標也可用來衡量動物的壓力和痛苦。確定觀測指標后，對部分重要指標還需要進行選擇和優化。例如當某種特殊疾病或在有毒情況下動物狀況發生惡化時，低溫也可能成為動物情況惡化的重要指標：流感病毒感染小鼠體溫的降低(低于32 ℃)預示著它們的死亡；細菌感染的小鼠體溫低于34 ℃的低溫預示著死亡。在大鼠關節炎模型中，抓撓次數的增加是關節炎發展最顯著的行為改變，表明其存在慢性疼痛。在一些醫學試驗中，當不明確動物對處理產生的效應時，使用少數動物進行預實驗來確定動物表現，有助于確定觀測指標及頻率。

3 中國

動物福利的3R原則首次出現在1997年《關于“九五”期間實驗動物發展的若干指導意見》中[10]。為適應國際上動物福利的發展趨勢，2006年科技部發布了《關于善待實驗動物的指導性意見》，明確指出“善待實驗動物”就是倡導3R原則。

國家標準(GB/T 27416—2014)《實驗動物機構質量和能力的通用要求》第七章中，有5個條款和6個條款對安樂死術和人道終點的實施提出了要求。強化了實驗動物人道終點和安樂死術的重要性，在組織機構設置、工作內容安排、工作程序運作、基本原則的把握等方面為實驗動物機構的良好運作提供了制度上的保證。相對而言，該標準提出的要求還是概略性的、原則性的，內容還不夠具體細化，對于評價的內容以及如何評價沒有做出具體的規定和建議。對于實際工作中遇到的具體問題難以給出具體的指導，在很大程度上還需要依靠人為裁定，不利于管理實施。若要對具體的實驗動物福利工作進行指導，這兩部分內容需要進一步的細化和完善，以利于實際工作的開展和持續評估。

4 展望

西方發達國家在實驗動物仁慈終點及安樂死的實施方面已經建立了完整的理論體系，與其相比，我國在法規標準體系建立方面還處于起步階段，需要盡快補充和完善。

當前我國實驗動物服務業正在快速融入全球經濟發展的步伐中，動物福利相關法規、標準都應盡快完善，建立符合國際規范的動物福利審查、實施、評價制度。同國外相關人道處死動物的法律法規相比，現階段我國在實驗動物安樂死依據及方法相關內容的起草處于起步階段。應借鑒其他國家的制定內容，細化相關條文并加強可操作性，為解決實際工作中的問題提供指導。

值得注意的是，實驗動物福利相關法律是一把雙刃劍，完備的法律法規可以增強我國實驗動物產品在國際貿易中的競爭力，反之則會增加不必要的負擔[11]。因此制訂工作必須根據我國生物醫學研究方面的國情因地制宜。完善的法規內容將有助于實驗動物福利工作的開展和評估，對于加強我國實驗動物的福利管理具有重要的意義；有助于提高認可結果的公信力，促進政府部門對認可結果的采信；加快實驗動物機構認可制度認可結果的國家間互認，繼而實現國際間互認的步伐；突破實驗動物相關技術性國際貿易壁壘，加快實驗動物相關科研和產業的國際化交流和發展。