不同周齡、性別、環境下SD大鼠自發病變的病理學研究*

李恒華 施汀蘭 王天文 羅金萍 張 莉 黃文濤

(重慶市中藥研究院，重慶市藥物安全評價中心，重慶 400065)

新藥的安全性評價中，實驗動物組織器官的毒性病理學檢查是非常重要的檢測項目。SD大鼠因其具有個體差異小，試驗數據較準確等優點，成為國際上生物醫學領域公認的實驗動物[1]，也是常用的進行藥物安全性評價研究的嚙齒類實驗動物。由于其自身或外界的影響，常會出現一些自發性疾病(即實驗動物未經任何有意識的人工處理，在自然情況下所發生的疾病[2])，對病理診斷結果的判斷產生直接的影響，從而干擾了對藥物引起的組織器官病變的正確評價。因此，了解其重要臟器的自發病變情況，才能正確評價實驗中出現的病理學改變，從而得出正確的結論。隨著現代醫學、生物學等生命科學的迅速發展，對實驗動物質量的要求也越來越高。實驗動物的質量，直接影響到動物實驗研究結果的精確性和可重復性，實驗動物的自發病變已成為影響動物質量和干擾動物實驗結果的重要因素，對現有飼養條件下自發病變的調查和研究，已成為實驗動物標準化和實驗動物病理監測的重要內容。

為探討不同飼養環境下不同周齡以及不同性別SD大鼠自發病變的異同，并完善SD大鼠自發疾病的病理學背景資料，本研究觀察了本中心共計976只空白對照SD大鼠的主要組織器官的自發性病變的種類及其發生率，并進行了統計和分析，以期為生物醫學和藥物的安全性評價研究提供動物臟器自發性病變的基本資料。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

甲醛(重慶川東化工集團有限公司)；二甲苯(重慶川東化工集團有限公司)；無水乙醇(重慶川東化工集團有限公司)；伊紅(成都瑞琦科技實業有限責任公司)；蘇木素(珠海貝索生物技術有限公司)；鹽酸(重慶川東化工集團有限公司)；組織自動脫水機，德國徠卡有限公司，型號TP1020；高級智能脫水機，德國徠卡有限公司，型號ASP300S；生物組織自動包埋機，湖北泰維醫療科技有限公司，型號TB-718；輪轉切片機，德國徠卡有限公司，型號RM2135和RM2235；恒溫攤片烤片機，湖北泰維醫療科技有限公司，型號TK-218；生物組織自動染色機，湖北泰維醫療科技有限公司，型號TR-180；光學顯微鏡，奧林巴斯株式會社，型號CH30和CX31。

1.2 動物

SPF級SD大鼠，總計976只，為近8年內藥物安全性評價試驗空白對照組用動物，其中10周齡雌雄SD大鼠總計為112只，19周齡雌雄SD大鼠總計為363只，23周齡雌雄SD大鼠總計為128只，32周齡雌雄SD大鼠總計為228只，36周齡雌雄SD大鼠總計為145只。動物由本院實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(渝)2007-0006，SCXK(渝)2012-0006。一部分實驗大鼠(總計為650只)飼養于全屏障SPF級動物實驗房內(飼養室溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%)，喂以大小鼠維持飼料，自由進食，飲水為純化水，裝于消毒過的飲水瓶內自由飲用。一部分實驗大鼠(總計為326只)飼養于普通級動物實驗房內(飼養室溫度19～28 ℃，相對濕度40%～70%)，喂以大小鼠維持飼料，飲水為生活飲用水，自由進食進水。動物房使用許可證號：SYXK(渝)2007-0003，SYXK(渝)2012-0003。飼料購自北京科澳協力有限公司。

1.3 方法

安樂死方法處死動物，所有動物處死前禁食不禁水，經戊巴比妥鈉麻醉，用注射器腹主動脈采血后放血處死后進行大體解剖。觀察各臟器的位置、形狀、大小、顏色、軟硬度等，確定是否有異常情況。將下列組織用10% 的中性甲醛溶液固定，供進一步組織病理學檢查：心、肝、肺、腎、脾、腦、脊髓、氣管、主支氣管、食管、胰腺、胃、腸(十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、盲腸)、腎上腺、垂體、甲狀腺(包括甲狀旁腺)、胸腺、淋巴結、骨髓、眼球、睪丸、附睪、前列腺、精囊腺、卵巢、子宮、乳腺、陰道、膀胱、皮膚、骨骼肌、坐骨神經、主動脈、頜下腺等臟器。取固定的組織和器官，經常規脫水后石蠟包埋、切片、HE染色、光學顯微鏡下進行組織病理學檢查。

1.4 統計方法

實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件進行統計處理。兩樣本率的比較采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 不同周齡大鼠自發病變及發生率

在屏障系統和普通環境的正常飼養條件下，SD大鼠連續30余周喂養期間，經組織病理學檢查，雌雄大鼠均未出現腫瘤病變。心臟、肝臟、肺、腎臟、胰腺、氣管、主支氣管、前列腺、睪丸、子宮和陰道均發現了各種類型的非腫瘤病變，其主要病變多為炎性細胞浸潤，病變程度都較輕，多以點狀、灶狀為主，總體發病率不高。SD大鼠大腦、小腦、主動脈、食管、甲狀腺、腎上腺、胸腺、小腸、大腸、胃、脾、唾液腺、垂體、骨髓、膀胱、脊髓和卵巢等未發現明顯自發病變。

隨著大鼠周齡的增長，在屏障環境和普通環境飼養條件下，大鼠常見自發性病變,病變程度和發病率大部分均有所增加，在范圍和程度上總體均呈現逐漸加重的趨勢。提示SD大鼠大部分自發病變及發生率可隨周齡增長而增加。受檢臟器的數量及自發病變發生率詳見表1、表2。

2.2 不同性別大鼠自發病變及發病率

SD大鼠自發性病變中，在屏障環境和普通環境飼養條件下，少數病變均呈現較為明顯的性別差異。其中，進行性心肌病雌雄差異最為明顯，在兩種環境下雄性發病率均遠高于雌性(P<0.05或P<0.01)，其次為腎臟礦物質沉著，在兩種環境下雌性發生率均明顯高于雄性(P<0.05)。雄性胰腺萎縮的發病率也有高于雌性的趨勢。其余病變的性別差異無明顯統計學意義。詳見表3、表4。

2.3 不同飼養環境下大鼠自發病變及發生率

與屏障系統相比較，普通環境大鼠肺、氣管和主支氣管的自發病變率明顯升高(P<0.05或P<0.01),其余臟器組織的病理改變兩者間未見明顯差異。詳見表5(主要列出病變發生率有顯著差異的臟器組織)。

表1 屏障環境下不同周齡SD大鼠自發病變及發生率(%)Table 1 Spontaneous lesions and incidences of SD rats at different weeks of age under the center barrier(%)

表2 普通環境下不同周齡SD大鼠自發病變及發生率(%)Table 2 Spontaneous lesions and incidences of SD rats at different weeks of age under the ordinary environment(%)

表3 屏障環境下不同性別SD大鼠自發病變及發生率(%)Table 3 Spontaneous lesions and incidences of SD rats of different genders under the center barrier (%)

注：*P<0.05，雌vs 雄；**P<0.01：雌vs 雄

Note：*P<0.05female vs male；**P<0.01，female vs male

表4 普通環境下不同性別SD大鼠自發病變及發生率(%)Table 4 Spontaneous lesions and incidences of SD rats of different genders under the ordinary environment (%)

注：*P<0.05，雌vs 雄

Note：*P<0.05，female vs male

表5 不同飼養環境下SD大鼠自發病變及發生率(%)Table 5 Spontaneous lesions and incidences of SD rats at different weeks of age under different environments(%)

注：*普通環境vs 屏障環境，P<0.05；**普通環境vs 屏障環境，P<0.01

Note：*the ordinary environment vs the center barrier，P<0.05；**the ordinary environment vs the center barrier，P<0.01

3 討論

在藥物安全性評價中，SD大鼠是應用廣泛的實驗動物，明確其背景資料，了解其各組織器官的自發性病變種類及發生率對試驗研究具有重要的指導意義。本中心對不同飼養環境下SD大鼠的主要臟器進行了病理組織學觀察，結果發現試驗期間SD大鼠未出現腫瘤病變。心臟、肝臟、肺、腎臟、胰腺、氣管、主支氣管、前列腺、睪丸、子宮和陰道等均見不同程度的病理學改變。本研究中所觀察到的SD大鼠自發病變與其他實驗室的報道比較并無特殊的自發病變[3-6]。

環境因素主要指空氣質量、溫度、濕度等，也包括原因未明的傳染因子。本研究結果顯示，與屏障系統相比較，普通環境大鼠肺、氣管和主支氣管的自發病變率明顯升高(P<0.05或P<0.01),提示實驗環境主要對SD大鼠呼吸系統的自發病變具有明顯影響，因此嚴格控制實驗環境是降低呼吸道自發病變發生率的有效措施，對保證實驗結果的可靠性具有重要意義，同時本研究結果也為實驗動物飼養環境對動物自身疾病的影響提供了重要依據。

在進行藥物多次給藥毒性評價時，需要區別組織病理學檢查所觀察到的病變是染毒相關的病變還是動物的自發病變，這主要通過統計學顯著性檢驗進行判斷；與對照組相比，如果高劑量組病變發生率增高具有統計學顯著性差異，則可考慮病變的發生與染毒具有相關性。然而，在每組動物數不變的情況下，如果對照組動物病變(自發性病變)發生率很高，則可降低統計學顯著性檢驗的效率，掩蓋受試物所引起的病變發生率的增高，干擾對研究結果的準確評價[7]。因此，動物自發性非腫瘤病變的發生率對于評價藥物多次給藥毒性試驗結果具有重要的參考價值，實驗室背景數據對判定藥物是否引起常見自發性疾病的發生率改變至關重要。而正常情況下SD大鼠的許多重要組織器官均有不同程度的病理改變，這對生物醫學實驗和藥物的安全性評價有重要影響。所以要加強飼養，提高動物質量，加強實驗動物自發病變的病理監測，了解常見病變的發生規律。同時在藥物安全性評價中，比較給藥組大鼠與對照組大鼠的病理變化時，一定要考慮大鼠的病變是自發還是受試物本身引發的[8]，應詳細了解大鼠自發性病變特點的背景資料，慎重分析，合理評估。

此外，本研究還提示，SD大鼠大部分自發病變及發生率隨周齡增長而有增加的趨勢。同時，在SD大鼠自發性病變中，在屏障環境和普通環境飼養條件下，少數病變均呈現較為明顯的性別差異，其中，以進行性心肌病和腎臟礦物質沉著最為明顯。這些發現與以往的研究報道基本一致[7-10]。有研究報道[8]，Wistar大鼠隨周齡增加其進行性心肌病的發病率及病變程度均明顯增加，雄性發病比雌性早，發病率高，且病變嚴重，該結果與本研究(SD大鼠)十分吻合。本研究中腎臟礦物質沉著主要發生在腎小管內，周圍未見明顯的病理性病灶，因此主要考慮為轉移性鈣化；該病變雌性發病率明顯高于雄性，與以往研究結果一致[9-10]。雌雄病變發生率差異的具體原因還有待進一步研究探討。

目前國內鮮有SPF級SD大鼠在正常飼養條件下主要臟器常見病理變化的種類及其發生率的報道。本研究積累了SD大鼠常見自發病變的數據，作為本實驗室的歷史對照值，為今后建立組織病理學自發病變背景數據庫奠定了基礎，也為有關技術人員提供參考，有利于解決準確判斷正?；虍惓祿募夹g難題，提高對藥物靶點定位的準確度。在不同實驗室，大鼠各種自發性病變的發生率會有一定差別，這可能與所采用的大鼠的品系、批次、動物飼養環境條件、動物管理、病理診斷標準等因素有關。各實驗室有必要充分了解所選用動物自發疾病的背景資料，并在平時工作中積累實驗數據，建立自己實驗室的病理自發病變數據庫，為正確開展和合理評價藥物安全性研究提供基礎[11]。