小型豬近交系鑒定研究進展*

馮書堂 牟玉蓮 王太平 莊愛萍

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)(2.北京蓋蘭德生物科技有限公司， 北京 100007)

由于近交系動物遺傳穩定、反應靈敏、生物學特性一致性好，能提供精確、科學的檢測結果，已廣泛應用于生命科學眾多領域，如單克隆抗體制備等，并由此創建了多項具有劃時代意義的理論學說，帶來了年收益達上億元的生物醫藥價值[1]。哺乳動物近交系動物，已成為解決人類疑難病癥和生命基礎科學領域研究中不可或缺的技術平臺之一。

自Clarence C. Little于1909年研究建立了第一個近交系鼠以來[2]，先后建立了同工酶蛋白質鑒定研究、生化標記鑒定研究、微衛星變異和異體皮膚移植鑒定技術方法，如，相關生理生化標記、DNA指紋圖、皮膚移植、DNA遺傳標記、SNP分析等分子遺傳學的方法[3]。隨著哺乳動物近交系小鼠遺傳鑒定的研究方法標準的建立，大大加快了哺乳動物遺傳近交系培育與應用研究的步伐，目前已培育出數百種近交系鼠類等小型哺乳動物。

由于大型哺乳動物豬在生殖、生理、代謝等的諸多特異性，上世紀50年代雖大規模地開展了近交系豬培育研究未獲得成功，所以其鑒定研究也未有建樹。隨著近50年來中國在大型哺乳動物近交系豬資源創新研究中取得了突破性進展，參照近交系鼠國際公認的技術方法，先后開展了同工酶蛋白質、DNA遺傳標記、特異等位基因、SNP分析和異體皮膚移植鑒定技術等方法[4-10]，使大型哺乳動物近交系實驗用小型豬鑒定研究取得了重大進展。分述如下：

1 創建了豬近交系異體皮膚移植鑒定方法

皮膚移植是鑒定近交系鼠類最經典、有效的方法， 國內外有關近交系鼠異體皮膚移植鑒定已有許多報道[10]。依據近交系鼠皮膚移植鑒定技術原理，結合實驗用小型豬的生理種質特性，中國的Mu等與解放軍304醫院合作研究[11]，以近交系F20為材料，率先開展了五指山小型豬近交系異體皮膚移植鑒定方法研究，未發生免疫反應，證明五指山小型豬近交系培育成功。創建了近交系豬的異體皮膚移植鑒定方法，其技術要點如下：(1)需對試驗組(異體皮膚移植)和對照組(自體皮膚移植)公母豬合理安排；(2)測試用豬大小限制在3.5月齡以內；(3)皮瓣移植面積不小于4 cm×6 cm；(4)每周需對皮膚創面觀察一次，連續4周。早期7～14 d，主要觀察移植創面皮膚顏色、血運建立及移植皮膚的存活率等；移植14 d以后，觀察移植創面無明顯紅腫、滲出、水泡、脫屑、脫落、潰瘍、壞死等排斥反應現象；(5)觀察期同時對其進行外周血與免疫相關細胞、生長因子等測定，進行移植皮膚和正常皮膚免疫組化H.E、Masson染色等超微結構變化觀測。依據上述5種研究結果，實驗豬與對照組兩組間是否反應一致，最終可判斷為測試豬異體皮膚移植未發生免疫排斥反應，即可判斷該測試近交系豬培育成功。這一鑒定方法，為大型哺乳動物近交系的鑒定提供了科學依據。截至目前，國外雖有近交系豬異體皮膚移植研究論文[11-12]，但國內、外均未見如此全方位、系統的近交系豬異體皮膚移植鑒定技術方法的報道。

2 建立了豬近交系鑒定基因組水平鑒定標準

據國內、外研究報道，通過利用Illumina豬高密度SNP芯片(6萬個SNPs)對豬、牛、雞、鼠等動物遺傳資源進行遺傳學評估與開發利用已屢見不鮮，但用于近交系豬鑒定還未見報道。我國馮書堂等[3]，曾將此技術用于近交系豬F17～F22共6個世代的遺傳檢測研究，并以非近交系海南五指山豬為對照組，共計112個樣品，研究結果證明，分布于近交系18對常染色體上的50 418個有效SNPs中，該近交系群體F20SNPs已被固定的比例高達80.0%以上。隨著世代的推進，幾乎在所有的染色體上都有一些區域有規律地被慢慢固定，雜合度由大到小直至為0，而非近交系海南五指山豬群體幾乎所有染色體區域均表現高度雜合，50 418個有效SNPs呈彌漫性、均勻性、無規律地分布于18個染色體上，發現了近交系豬“不純合”基因的遺傳現象，揭示了近交系豬群體基因雜合度均為1的分子遺傳特征。利用豬近交系鑒定基因組水平驗證策略及手段，證明培育出的近交系是一種新的遺傳種質資源，如圖1所示。

圖1 近交系WZSP與非近交系海南WZSP 1號染色體上50 418個SNPs的純合度分析(選自：遺傳，2016.28(3):178)Fig.1 Homozygosity analysis of 50 418 SNPs between the inbred lineWZSP and non-inbred line Hainan WZSP on Chr. 1

依據Illumina豬高密度SNP芯片分析結果，可將WZSP近交系與WZSP非近交系區分開來，并提出了該近交系與非近交系 WZSP的鑒定標準，已分別授權國家發明專利(ZL201410152864.5；ZL201410562272.0； US9029090B2)等[13-15]。

3 建立了五指山小型豬近交系其他多種鑒定方法

據報道利用SNP位點分析、微衛星標記、特異性等位基因等對不同豬品種進行遺傳分析已有多年并有許多報道[9，16-18]，已建立了多種近交系豬的鑒定方法：

3.1 同工酶蛋白質鑒定研究[9]

在眾多的蛋白質和微衛星標記中，以哪些標記作為遺傳控制的標準？我國科學研究人員李奎等，參照前人在豬品種中做過的標記位點，建立的方法，以及哺乳動物實驗動物小鼠和大鼠的位點的標準，考察這些位點在染色體的分布。選擇可以代表實驗用豬特點的6種標記，如表1。

表1 蛋白質標記、染色體分布、組織來源Table 1 Protein markers, chromosomedistribution, tissue sources

蛋白質標記檢測采用了最常用的電泳方法，對該近交系與貴州小型豬、廣西巴馬小型豬比對，研究發現：依據三品系實驗用小型豬在6個蛋白質標記等位基因頻率的分布差異性，發現AKP蛋白質標記AA型，可作為該近交系與貴州、廣西巴馬小型豬品系間鑒定方法之一[9]。

3.2 特異性微衛星分子遺傳標記研究

我國馮書堂等報道[9]在微衛星檢測、 選用微衛星標記研究中，選擇、提出21個具有通用性、多態豐富性、有效性：如下四個特點微衛星位點，具有通用性：屬于美國豬基因組協作計劃推薦的第11組用于遺傳多樣性和親緣鑒定研究的微衛星標記。具有分布廣：選擇的21個位點在豬單倍體中的每條染色體中都有，且1號和3號染色體的兩個標記分布于染色體的不同臂，這些引物在普通豬群的多態性都很好，等位基因數最少的為4；其中的14對標記S0155、SW240、SW72、SW0227、S0005、S0228、S0101、S0355、SW911、SW951、S0386、S0090、SW769、SW857，研究證明被用來進行奧地利豬種(長白、皮特蘭和大白豬)的親子鑒定，其中10對引物進行多重PCR的鑒定結果的可靠性都在99%以上。

研究所用S0155，CGA，SW240，S0005等21對微衛星標記，分別在1q、1q、2p、5q染色體位點上、分別具有6、12、8和10個等位基因數，研究表明，可以得到用于三個小型豬品種準確分辨的座位有SW24，SW951,S0005,S0101，SW769，S0355，SW902，SW72，S0218，S0090，CGA。三個小型豬品種中特有等位基因共96個，其中貴州小型豬有49個，WZSP近交系有22個，廣西巴馬小型豬有25個，這些片段可以用作三個小型豬品種個體的遺傳鑒定。尤其S0005位點只wzsp近交系完全純合，可作為該近交系與貴州、廣西小型豬之間的鑒定標準與方法[9]。不同品種的豬的基因型檢測結果見表2。

表2 不同品種豬的Pnas-4基因StyI多態檢測結果Table 2 Polymorphism detection results of pnas-4 gene StyI in pigs of different breeds

結果表明，五指山小型豬近交系只存在CC基因型和C等位基因，而其它品種的豬存在T等位基因。該輔助鑒定五指山小型豬近交系的方法及其專用引物，已授權美國發明專利(US9029090B2)[15]；此外，利用該近交系與貴州香豬、廣西巴馬小型豬比對研究，發現在SW24等10個基因座位上有22個特異等位基因，可做為三品種間的區別鑒定方法，亦可作為其鑒定方法[9]；SW936 位點以作為“五指山小型豬的一種分子標記及其應用”，已授權國家發明專利(ZL200510008994.2)等遺傳特異性，均可以作為鑒定方法，把該近交系同其他品種豬區別開來[19]。

4 異體皮膚移植技術是近交系最佳鑒定方法

研究表明，同工酶蛋白質特異性鑒定研究，作為物種檢測遺傳特性的一種方法，是基于20世紀60年代蛋白電泳技術的出現而應用。但是，蛋白和同工酶都是基因的表達產物，非遺傳物質本身。蛋白電泳所檢測的主要是血漿和血細胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的變化，其測定結果易受檢測對象環境和發育狀況的影響，以及蛋白電泳檢測諸多條件的限制影響。因此，這些因素決定了蛋白電泳檢測技術數據具有一定的局限性，但由于蛋白電泳技術操作簡便、快速及檢測費用相對低廉，目前仍是非近交系物種之間生化遺傳鑒定的方法之一。

特異性微衛星分子遺傳標記研究，是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是 DNA 基因水平遺傳多態性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記鑒定方法——同工酶蛋白質、形態標記、同工酶標記、細胞標記[3]相比DNA遺傳標記包括特異等位基因、SNP分析等鑒定技術[4-9]，DNA基因分子標記等具有較高科學性，由于大多數分子標記為共顯性，不受生物發育階段、不同組織的影響；基因組變異極其豐富，基因分子標記的數量多，但少量基因不影響目標性狀的表達，與性狀的主效基因連鎖性不強，使其有時應需選擇多個檢測目的基因才能達到目的。其檢測手段具有快速、準確性能高，是目前非近交系物種鑒定的方法之一，但因基因分子標記鑒定程序需引物合成、測序需使用特殊儀器設備，相對而言技術復雜、且費用高，尤其是豬高密度SNP芯片技術所需測定費用更高，多數用于特殊情況下如法學等非近交系物種之間的鑒定。

異體皮膚移植應是近交系動物鑒定的最經典、有效方法，是基于該近交系品種(或品系)是來源于非近交系種群，近交系雖是具有等位基因高度純合的特殊的遺傳群體，但其遺傳結構基因幾乎100%來源于某培育它的非近交系一品種(或品系)。因此，他們具有共同的遺傳基礎，如特殊基因等，具有來源某一非近交系品種群體的特征和某些共同等位基因的群體。因此，利用上述同工酶蛋白質、DNA遺傳標記、特異等位基因等技術，可以鑒定該近交系與其他品種(或品系),但就很難利用此方法找出、提供其與來源某一品種群體不同的、量化指標、令人信服的證據。由于科學發展到目前的局限性，還未建立起公認的近交系高通量SNP技術鑒定標準，所以利用高通量SNP技術手段，也難以提供量化指標、令人信服的證據。

大量的研究結果已證明，近交系動物基因高度純合、免疫抗原高度一致，其異體器官移植不會發生免疫排斥反應；而皮膚免疫排斥為典型的細胞免疫排斥反應，只有自體和同系皮膚移植才不會產生免疫排斥[20]，又是排斥反應最為直觀的器官。因此，利用異體皮膚移植鑒定近交系正是基于這兩大特點，可有效地把近交系同培育的來源供體品種(或品系)區別開來、更能同其他品種區別開來。

我國開展的豬異體皮膚移植未發生免疫排斥反應，不僅驗證近交系培育成功，也為大型哺乳動物近交系鑒定，提供科學的檢測技術和方法，包括：實驗動物測試月齡、皮膚移植面大小、觀測方法與時間、外周血項因子測定等，一整套系統技術方法與數據[10]。截至目前，利用異體皮膚移植技術，全方位、系統的鑒定近交系豬，國內、外均未見報道。

5 提出近交系豬5條鑒定標準(草案)

基于上述研究與分析，中國農科院北京畜牧獸醫研究所科研人員，2013年在農業部組織的“五指山小型豬近交系培育成功”專家鑒定會上，提出了“提出近交系豬6條鑒定標準”(草案)。在國家科技部實驗動物專家委員會多位專家參于下，依據國際有關嚙齒類近交系鼠類的規定和近交系鼠的遺傳監測方法，基于該近交系豬種質和分子遺傳特異性，修改為5條鑒定標準(草案)刊登在《實驗動物科學》[21]。

上述標準(草案)的提出，將為我國創新資源近交系豬培育和開發利用奠定科學基礎，同時為我國擁有自主知識產權的近交系小型豬新品系提供技術保障，無疑將促進我國人類生命科學、醫學產業鏈的發展，并使我國大型哺乳動物近交系研究處于國際領先地位。