MEG8-DMR對人肝癌Huh7細胞DLK1表達水平的影響

史嘯坤 楚晨

【摘要】目的 DLK1-DIO3印記區間位于人14號染色體、小鼠12號染色體上，在兩者的表達中高度保守，其間有三個父本控制的蛋白質編碼區域，以及多個母本控制的非編碼轉錄本，還有大量的C/D snoRNA和microRNA。其間有三個差異甲基化區，分別為父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR，以及母本甲基化的MEG8-DMR。先前關于對MEG8-DMR的研究集中于腫瘤方面的較少，因此探究差異甲基化區MEG8-DMR對腫瘤發生的影響以及其調控機制，深入分析印記基因參與腫瘤的發病機理，具有重要的意義。方法 本實驗通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，先依據脫靶位點少的原則選擇sgRNA，構建重組載體并通過脂質體法將其轉染入Huh7細胞后檢測出重組載體在Huh7細胞系中對MEG8-DMR區域進行了有效的敲除。結果 敲除MEG8-DMR后細胞形態沒有發現明顯變化，同時發現敲除MEG8-DMR導致上游基因DLK1表達水平的下調。結論 本實驗中通過對MEG8-DMR的敲除，導致DLK1表達下調，而DLK1在幾種腫瘤包括神經纖維瘤、骨髓增生異常綜合征和肝癌患者的血清中呈高表達，且腫瘤的形成是多因素、多基因共同參與的結果，MEG8-DMR上下游區域分布著一系列母系表達非編碼轉錄本，和大量的miRNA和C/D snoRNA，因此，MEG8-DMR及臨近基因在肝細胞性肝癌的發生過程中可能具有表達調控的重要功能。

【關鍵詞】MEG8-DMR;肝細胞性肝癌;CRISPR/Cas9;Huh7細胞;DLK1

【中圖分類號】R 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095-6681.2019.1..03

【Abstract】Objective The imprinted region of DLK1-DIO3 is located on human chromosome 14 and mouse chromosome 12 and is highly conserved in the expression of both. There are three parental control protein coding regions and multiple maternal controlled non-coding transcripts，and a large number of C/D snoRNAs and microRNAs.There are three regions of differential methylation between the parental methylated IG-DMR and MEG3-DMR， and the maternal methylated MEG8-DMR. Previous a few studies on MEG8-DMR focused on tumors.Therefore，it is of great significance to explore the influence of MEG8-DMR on tumorigenesis and its regulation mechanism and to deeply analyze the pathogenesis of the imprinted genes involved in tumors.Methods In this study， CRISPR/Cas9 gene editing techniques were used to select sgRNAs based on the principle of less off-target sites，construct recombinant vectors and transfect them by liposome method.After incorporation into Huh7 cells， it was detected that the recombinant vector effectively knocked out the MEG8-DMR region in the Huh7 cell line.Results No significant changes in cell morphology were observed after knockout of MEG8-DMR.It was also found that the knockdown of MEG8-DMR resulted in the down-regulation of the expression level of the upstream gene DLK1.Conclusion In this experiment，the knockdown of MEG8-DMR resulted in the down-regulation of DLK1 expression.DLK1 was highly expressed in the serum of several tumors，including neurofibroma， myelodysplastic syndrome and liver cancer， and the tumor formation was multifactorial.As a result of multiple genes co-involved，a series of maternal expressive non-coding transcripts and a large number of miRNAs and C/D snoRNAs are distributed in the upstream and downstream regions of MEG8-DMR.Therefore，MEG8-DMR and its adjacent genes may play an important role in the regulation of hepatocellular carcinoma.

【Key words】MEG8-DMR;Hepatocellular carcinoma;CRISPR/Cas9;Huh7 cells;DLK1

基因組印記是經典的表觀遺傳學現象，常表現為父源或母源一方的等位基因表達，而另一方的等位基因沉默。之前的研究表明，在這樣的印記基因簇中，總分布著一些差異甲基化區，即父本和母本具有不同甲基化狀態的區域，且這些差異甲基化區對印記基因的調控有重要的作用[1]。

DLK1-DIO3印記區間位于人14號染色體、小鼠12號染色體上，在兩者的表達中高度保守，其間有三個父本控制的蛋白質編碼區域，以及多個母本控制的非編碼轉錄本，還有大量的C/D snoRNA和microRNA。其間有三個差異甲基化區，分別為父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR，以及母本甲基化的MEG8-DMR[2]。

之前的研究表明，在MEG8-DMR的上游和下游分別定點整合和插入AAV腺病毒載體和Sleeping Beauty 睡美人轉座子會促進肝癌的發生[3-4]，DLK1-DIO3印記區間中的DLK1、RTL1、MEG3以及microRNA也與肝癌的發生密切相關[5]。因此，探究差異甲基化區MEG8-DMR對腫瘤發生的影響以及其調控機制，深入分析印記基因參與腫瘤的發病機理，無疑具有重要的意義。

CRISPR/Cas9系統是目前基因組編輯領域最受歡迎的新方法。CRISPR/Cas9來源于簡單的細菌免疫系統，經過人為改造后，可在真核細胞中實現高度靈活且特異的基因組編輯[6]。CRISPR/Cas9系統已經成功應用于植物細菌酵母魚類以及哺乳動物細胞，也是目前最高效的基因組編輯系統。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人肝癌Huh7細胞系由本實驗室保存;CRISPR/Cas9質粒骨架載體為本實驗室改造后的pX458載體;質粒提取試劑盒購自Axygen公司;轉染試劑LipofectamineTM 2000 Reagent購自Invitrogen公司;DMEM培養基購自Gibco公司;進口胎牛血清購自Hyclone公司;青鏈霉素購自Hyclone公司;嘌呤霉素購自Sigma公司;RNAiso Plus、SYBR?Green PCR Master Mix、PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒購自TaKaRa公司;MTT粉末購自北京索萊寶科技有限公司;DMSO購自Sigma公司。

1.2 重組載體的構建以及sgRNA的設計

1.2.1 sgRNA的設計

在網站http：//crispr.dbcls.jp/中輸入欲敲除的片段，根據網站給出的結果，依據脫靶位點少的原則，選擇sgRNA-F和sgRNA-R，即紅色三角形所示位置，從而對MEG8-DMR進行敲除。

1.2.2 構建重組載體及重組載體的轉染

在本實驗原有的pX458質粒的基礎上，首先分別用限制性核酸內切酶Bbs1與Bsa1對其進行切割，再將sgRNA-F和sgRNA-R連入酶切位點，通過脂質體法，使用Lipo2000，利用細胞膜的電性與Lipo2000相互吸引，進而將重組載體傳染入人肝癌Huh7細胞。

1.3 目的克隆的篩選

1.3.1 藥物篩選

轉染24 h～48 h后，鑒于載體本身攜帶的Puro篩選標簽，加入含有嘌呤霉素的培養液，Huh7藥篩濃度為2.5 ug/mL。藥篩三天后，有限稀釋法重新鋪于96孔板中，對所獲得單個克隆進行繼續培養。

1.3.2 PCR檢測

利用酚氯仿法，提取單克隆擴大培養后的細胞的基因組DNA，并對其進行PCR檢測，對顯示有目的條帶的實驗組進行瓊脂糖凝膠電泳回收，然后進行測序，進一步分析其敲除情況，敲除鑒定引物。

1.4 檢測Huh7細胞中DLK1表達水平變化

1.4.1 DLK1表達水平檢測

通過Trizol法提取細胞總RNA，并將其反轉錄為cDNA，通過實時定量PCR檢測DLK1基因在mRNA水平表達的變化。

2 結 果

2.1 重組載體成功轉入目的細胞

根據綠色熒光蛋白的表達，可以看出重組載體成功轉染入人肝癌Huh7細胞。

2.2 單克隆篩選鑒定

通過測序比對基因組敲除情況，對野生型細胞、E5號克隆、B7號克隆進行基因組PCR鑒定，野生型條帶大小為1528 bp。電泳顯示E5號克隆在約350 bp處可見敲除帶。

測序比對顯示，重組載體在上游靶位點附近和下游靶位點外行使對MEG8-DMR敲除效應，成功敲除1190 bp，兩敲除位點10 bp內存在一定的堿基修復差異。E5號克隆確定為本研究實驗組目的克隆細胞株。

2.3 細胞形態比對

將野生型細胞和E5號克隆進行細胞形態比較，細胞形態沒有發現明顯變化。

2.4 實時定量分析DLK1的表達變化

實時定量PCR檢測野生型Huh7細胞和E5號克隆DLK1表達水平變化，發現E5號克隆mRNA的表達與野生型細胞相比明顯較低。

3 結 論

（1）重組載體可在Huh7細胞系中對MEG8-DMR區域進行有效敲除。（2）敲除MEG8-DMR后細胞形態沒有發現明顯變化。（3）敲除MEG8-DMR導致上游基因DLK1表達水平的下調。

4 討 論

本實驗中通過對MEG8-DMR的敲除，導致DLK1表達下調，而DLK1在幾種腫瘤包括神經纖維瘤、骨髓增生異常綜合征和肝癌患者的血清中呈高表達[7]，且腫瘤的形成是多因素、多基因共同參與的結果， MEG8-DMR上下游區域分布著一系列母系表達非編碼轉錄本，和大量的miRNA和C/D snoRNA，因此，MEG8-DMR及臨近基因在肝細胞性肝癌的發生過程中可能具有表達調控的功能，有待于進一步進行研究。

參考文獻

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[2] Court F，Tayama C，Romanelli V，et al.Genome-wide parent-of-origin DNA methylation analysis reveals the intricacies of human imprinting and suggests a germline methylation-independent mechanism of establishment.[J].Genome Res.2014，24（4）：554-569.

[3] Donsante A，Miller D G，Li Y，et al.AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma[J].Science，2007，317（5837）：477.

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[5] Lin S P，Youngson N，Takada S，et al.Asymmetric regulation of imprinting on the maternal and paternal chromosomes at the Dlk1-Gtl2 imprinted cluster on mouse chromosome 12[J].Nature Genetics，2003，35（1）：97-102.

[6] 鄭武，谷峰.CRISPR/Cas9的應用及脫靶效應研究進展[J].遺傳，2015（10）：1003-1010.

[7] Jelinic P，Shaw P.Loss of imprinting and cancer[J].Journal of Pathology，2007，211（3）：261.

本文編輯：劉欣悅