雞絳蟲寄生菌種的PCR鑒定及其進化關系分析

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雞絳蟲病是由扁形動物門絳蟲綱戴文科賴利屬的多種絳蟲寄生于肉雞、蛋雞及多種家禽小腸中引起的一種寄生蟲性疾病。據報道可感染雞的賴利屬絳蟲已達200多種，其中最常見的為棘鉤賴利絳蟲、四角賴利絳蟲和有輪賴利絳蟲[1-2]。雞感染絳蟲表現為精神沉郁、食欲減退、生長發育受阻，并伴有貧血、頑固性腸炎和下痢等癥狀。被絳蟲感染的病雞腸壁增厚，上可見大量出血點和結核狀結節[3]。除了對病雞造成直接的損害，雞絳蟲自身還攜帶大量的病原性超寄生物，可造成病雞的繼發性感染，增加病雞的死亡率。目前關于雞絳蟲病的研究主要集中在病原體種屬鑒定和宿主應答方面，而對絳蟲體內攜帶的超寄生物尤其是細菌和真菌種類知之甚少。

課題組前期收集了山西省雞感染絳蟲病例，并對分離的絳蟲進行了種屬鑒定，確定該絳蟲種類為棘溝賴利絳蟲[4]。在此基礎上，本研究設計用于鑒定細菌、真菌種類的通用型引物，旨在擴增寄生于雞棘溝賴利絳蟲體內的細菌和真菌DNA序列并進行測序，通過與NCBI數據庫中報道的相關序列進行BLAST比對，確定細菌和真菌的種類并進行系統進化關系分析，為山西省雞絳蟲病尤其是絳蟲引發的繼發性感染的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1蟲體 斷頸處死絳蟲感染病雞，剖開病雞腸道，收集寄生于腸道中的絳蟲蟲體。滅菌蒸餾水反復清洗蟲體后凍存于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購于天根生化科技(北京)有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒(D2300)購于北京索萊寶科技有限公司；PCR產物純化回收試劑盒(DR0203)購于杭州昊鑫生物公司；真菌、細菌通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PCR產物測序由上海美吉生物醫藥科技公司完成。

1.2 方 法

1.2.1PCR產物擴增 分別按照細菌和真菌基因組DNA抽提試劑盒操作說明提取絳蟲中細菌和真菌基因組DNA。細菌鑒定采用16s rDNA通用引物(F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTTAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增。反應體系：30 μL；反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共擴增40個循環。真菌鑒定采用18s rDNA通用引物序列(F：5′-TTAAGCCATGCATGTCTAAG-3′；R：5′-GACTACGACGGTATCTAATC-3′)進行PCR擴增。反應體系：30 μL；反應條件： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共擴增38個循環。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2目的基因序列測序 用DNA純化回收試劑盒回收目的產物，將PCR產物片段連接到pEASY-T3載體上，導入感受態細胞中。對轉化后的感受態細胞涂布于含Amp的LB培養板上進行篩選，挑取單個菌落在液體培養基中過夜生長，進行菌液PCR擴增。PCR擴增體系和條件同上，將菌液PCR結果為陽性的樣品送測序公司測序。

1.2.3分子鑒定與系統發育樹構建 將測序獲得的靶基因序列在NCBI數據庫中進行BLAST基因序列比對，從中選取相似性在95%以上的菌種序列，將所有選出的序列整理為fasta文本，使用MEGA5.1軟件進行序列聯配并構建系統發育樹，分析靶基因序列與已知序列的基因進化關系。

2 結 果

2.116s rDNA基因擴增及進化關系分析 實驗成功擴增出16s核糖體DNA(16s rDNA)目的序列，命名為SX-16s，產物長度為1 491 bp。將測序獲得的16s rDNA序列在NCBI數據庫16s rRNA(bacteria)中進行BLAST序列比對，根據比對結果，從中選取匹配度最高的，能反映不同種菌株16s rDNA特征的基因序列，在MEGA5.1中用鄰接法構建系統發育樹(圖1)。

圖1 16s rDNA基因序列系統進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of 16s rDNA

表1 細菌16s rDNA序列BLAST比對結果
Tab.1 Sequence alignment results of bacteria 16s rDNA by BLAST

菌株名稱NCBI序列號相似性Achromobacter spiritinusNR_117614.11470/1480 (99%)Achromobacter kerstersiiNR_152015.11466/1472 (99%)Achromobacter deleyiNR_152014.11466/1472 (99%)Achromobacter insuavisNR_117706.11463/1472 (99%)Achromobacter mucicolensNR_117613.11466/1479 (99%)Achromobacter pestiferNR_152016.11460/1472 (99%)Achromobacter aegrifaciensNR_117707.11459/1472 (99%)Achromobacter denitrificansNR_042021.11471/1491 (99%)Achromobacter piechaudiiNR_114102.11449/1456 (99%)Achromobacter xylosoxidansNR_044925.11455/1471 (99%)

圖2 16s rDNA測序基因與GenBank數據庫中無色桿菌(NR_117614.1)序列比對Fig.2 Sequence alignment of 16s rDNA with Achromobacter spiritinus (NR_117614.1) in GenBank

結果顯示，實驗擴增出的16s rDNA基因序列隸屬于無色桿菌屬(Achromobactersp.)，其對應菌株序列號為NR_117614.1、NR_152015.1、NR_152014.1、NR_117706.1、NR_117613.1、NR_152016.1、NR_117707.1、NR_042021.1、NR_114102.1和NR_044925.1，序列相似性均高達99%(表1)，其中與Achromobacter spiritinus (NR_117614.1)進化關系最近(圖1、圖2)。

2.218s rDNA基因擴增及進化關系分析 實驗成功擴增出真菌18s rDNA目的基因，命名為SX-18s，產物長度為952 bp。瓊脂糖凝膠電泳顯示產物條帶單一，大小與預期相符。將擴增出的18s rDNA基因進行測序，測序結果與NCBI數據庫中已鑒定的真菌序列進行比對。根據比對結果，從中選取匹配度最高的，能反映不同種真菌 18s rDNA特征的基因序列，在MEGA5.1中用鄰接法構建系統發育樹(圖3)，對應菌株序列號為：EU192367.1、EU192364.1、EU192362.1、LT671825.1、LT671817.1、DQ457640.1、KF706454.1、KF706456.1、KF706452.1、KF706453.1和KF706458.1(表2)。

表2 真菌18s rDNA序列BLAST比對結果
Tab.2 Sequence alignment results of fungus 18s rDNA by BLAST

菌株名稱NCBI序列號相似性Malassezia restrictaEU192367.1762/766 (99%)Malassezia globosaEU192364.1740/754 (98%)Malassezia sp.EU192362.1740/754 (98%)Malassezia sympodialisLT671825.1925/959 (96%)Malassezia sympodialisLT671817.1925/959 (96%)Malassezia pachydermatisDQ457640.1920/959 (96%)Malassezia equineKF706454.1871/903 (96%)Malassezia capraeKF706456.1 869/903 (96%)Malassezia dermatisKF706452.1869/903 (96%)Malassezia nanaKF706453.1867/903 (96%)Malassezia japonicaKF706458.1858/905 (95%)

結果表明，實驗擴增出的18s rDNA基因屬于馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)，其中與限制性馬拉色菌(Malasseziarestricta)進化關系最接近，序列相似性為99%(圖4)。 其它匹配菌株包括合軸馬拉色菌(Malasseziasympodialis)、厚皮馬拉色菌(Malasseziapachydermatis)、皮炎馬拉色菌(Malasseziadermatis)、Malasseziaequina和Malasseziacaprae等，其中Malasseziaequine和Malasseziacaprae為近年新發現的菌株(表2、圖3)。

圖3 18s rDNA基因序列系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of 18s rDNA

圖4 18s rDNA測序基因與GenBank數據庫中限制性馬拉色菌(EU192367.1)序列比對Fig.4 Sequence alignment of 18s rDNA with Malassezia restricta (EU192367.1) in GenBank

3 討 論

本研究檢測到寄生于雞絳蟲體內的細菌和真菌主要屬于無色桿菌屬和馬拉色氏霉菌屬。無色桿菌是寄生于昆蟲病原線蟲腸道內的一種共生細菌，對線蟲體內的共生菌起到主要的殺菌作用[5]。后來人們發現無色桿菌屬細菌中的一些種類具有致病性。木糖氧化無色桿菌是無色桿菌屬中一種非發酵的革蘭氏陰性機會致病菌，主要侵襲免疫力較低的機體，也可引起各種組織和器官感染[6-7]。本研究從雞絳蟲體內檢測到細菌DNA序列與糖氧化無色桿菌同源性達到99%，這提示雞感染絳蟲可能誘發機體發生無色桿菌誘發的繼發性感染。馬拉色菌是一種寄生于人和動物正常皮膚表面的真菌，可導致機會性感染，引起各種馬拉色菌屬相關疾病如花斑癬、毛囊炎及系統性感染等[8-9]。目前公布的馬拉色菌屬有14種[10]，其中限制性馬拉色菌、厚皮馬拉色菌、合軸馬拉色、皮膚馬拉色菌、Malasseziaequina、Malasseziacaprae、娜娜馬拉色菌(Malassezianana)、日本馬拉色菌(Malasseziajaponica)與本研究檢測出的真菌同源性較高，表明雞絳蟲病存在間接傳播馬拉色菌屬相關疾病的風險，這為雞絳蟲病尤其是雞絳蟲病誘發的繼發性感染的防治提供了參考依據。

利益沖突：無