114例HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌Spoligotyping基因分型研究

，， ，

目前，結核病仍是世界十大死因之一。根據2016年全球結核病報告，據估計2015 年全世界新發結核病數量約為1 040萬例，其中男性590萬(占56%)，女性350萬(占 34%)，兒童100萬(占 10%)。120萬新發結核病例為艾滋病毒感染者(占 11%)，超過95%的結核病死亡發生在低收入和中等收入國家[1]。分子流行病學是研究結核病傳播的有效手段，與傳統的流行病學研究相比，能夠更準確地預測疾病的傳播模式及其暴發流行模式，發現現有病例、新病例、特定傳播環境間的關系以及更易檢測出不同轄區病人間的傳播[2]。

目前，常用于結核分枝桿菌基因分型的方法有很多，主要包括間隔區寡核苷酸分型(Spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping)、多位點可變數目串聯重復序列分析(Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-Variable Number of Tandem Repeats，MIRU-VNTR)及插人序列6110(IS6110)限制性片段多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等[3]。Kamerbeek 等設計的Spoligotyping技術，是一種獨特的PCR方法，它擴增和標記直接重復(Direct Repeat，DR)區域的全部DNA間隔序列，使擴增后的 DNA與合成的寡核苷酸DNA序列探針雜交，然后根據雜交反應結果進行基因分型。該方法快速、簡便、重復性高，適合用于臨床標本，無須培養，是目前使用最頻繁的結核分枝桿菌 PCR 分型方法[4-5]。而且特別適用于IS6110 拷貝數少于5個的結核菌分離株的分子分型，適用于結核病暴發流行時確定出傳染源病例，確定實驗室交叉污染及實驗室或院內感染結核分枝桿菌菌株分布及優勢株等方面的研究[6-7]。

本研究采用Spoligotyping技術對采集的114例HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌進行基因分型研究，了解HIV/MTB雙重感染人群中結核分枝桿菌的基因型及其流行情況，對比其與單純感染MTB的結核分枝桿菌基因分型是否一致，探討其在今后HIV/MTB雙重感染病例中結核病控制中的應用價值。

1 材料與方法

1.1樣本來源 2014年至2016年，從江西省胸科醫院、南昌市第九醫院、南昌大學第一附屬醫院及廣州市第八人民醫院和云南省傳染病專科醫院共收集到診斷為 HIV/MTB 雙重感染114例住院患者結核菌樣本(鏡檢和培養均為陽性)。其中，江西省30例、廣東省48例、云南省36例。

1.2試劑及菌株 頗爾尼龍轉印膜購自上海必泰生物科技有限公司，ECL免疫印跡底物購自賽默飛公司，streptaridin-POD conjugate和CDP-star 檢測液購自德國羅氏公司，EDAC、SSPE、NaHCO3、NaOH、SDS、EDTA等購自生工生物公司、定影液和顯影液等購自銳珂醫療器材公司，43條探針引物由生工公司合成，序列見參考文獻[8]。結核分枝桿菌 H37RV 標準菌株來自中國疾病預防控制中心。

1.3DNA的提取 將一菌環培養基上生長良好的結核分枝桿菌溶于400 μL TE 緩沖液中，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心10 min，上清即為DNA 模板，-20 ℃冰箱保存備用。

1.4Spoligotyping分型 采用Kamerbeek 等推薦的Spoligotyping標準方法進行基因分型[4]。

1.4.1帶探針膜的制備 室溫下用新鮮配制的16% EDAC在塑料容器里震蕩孵育Biodyne C膜15 min使膜活化，后用150 μL 0.5 mol/L NaHCO3稀釋寡核苷酸探針至終濃度為0.125 μmol/L，將稀釋好的探針依次加入到膜中孵育。最后用2×SSPE/0.1% SDS洗膜后保存備用。

1.4.2PCR擴增 用一對引物擴增整個DR區。引物的序列為DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGAC-GAC-3′，DRb：5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。DRa引物5′端進行生物素標記。35 μL PCR反應就體系：Mix 18 μL，H2O 10 μL，DRa 2 μL，DRb 2 μL，DNA 3 μL。PCR 反應條件：96 ℃ 3 min，之后96 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個循環，最后72 ℃延伸6 min。

1.4.3雜交與監測 用150 μL 2×SSPE/0.1% SDS 稀釋PCR產物，100 ℃金屬浴后加到固定有探針的Biodyne C膜雜交1 h。洗膜后通過鏈霉親和素-過氧化物酶連接體streptaridin-POD conjugate孵育及CDP-star檢測液的檢測，最后用膠片曝光獲取結果。

1.4.4結果分析 將分型結果轉換后提交到數據庫平臺中進行比對分析http://www.miru-vntrplus.org，確定菌株的基因家族。

2 結 果

2.1菌株分析 114例HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌來自3個省份(按籍貫分包括廣東、江西、云南、湖北、湖南、貴州、重慶、山東、廣西和新疆)，其中6例流調資料不詳。剩下的108例病例中，包括男性96人，女性12人；年齡在20～30之間的20人，31～40之間的42人，41～50之間的25人，51～60之間的16人，60歲以上的5人(圖1)。婚姻情況以已婚為主，占65.7%(71/108)，感染HIV和MTB順序多數為先感染HIV后感染MTB，占94.4%(102/108)。

圖1 HIV/MTB雙重感染病例年齡構成Fig.1 Age composition of HIV/MTB co-infection patients

2.2基因分型情況 根據Spoligotyping圖譜構建

UPGMA進化樹，見圖2。聚類分析顯示，114例HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌成2個大的基因家族，即北京家族(Beijing Family)和非北京家族(non-Beijing Family)，分別占66.7%(76/114)和33.3%(38/114)，共30種基因型(表1)。其中，典型的北京家族基因型包含74個菌株，表現為僅與35-43之間的9個間隔區呈陽性雜交反應；另有2個菌株呈北京樣基因型，表現為35-43之間出現1個位點的陰性反應。此外，在HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌菌群中還存在T家族共18株(包含4種T1家族共11株、2種T2家族共2株、1種T2-T3家族1株，1種T3家族共3株和1種T4家族1株)，H家族共5株(主要為4種H3家族)，EAI5基因家族1株和CAS1_DEHLI基因家族1株。此外還存在12種基因型在數據庫中沒有對應基因家族或沒有匹配的結果。北京家族菌株和非北京家族菌株在性別和年齡組成方面差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 114例HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌Spoligotyping分型結果
Tab.1 Spoligotyping results ofMycobacteriumtuberculosisin 114 cases of HIV/MTB co-infection patients

Spoligotyping圖譜基因家族SIT號菌株數□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■Beijing174□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□■■■Beijing1901□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□■■■■Beijing2551■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T1537■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■□□□□■■■■■■■H3502■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T4401■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T110731■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T3373■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T11311■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T2521■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T210771■■■■■■■■■■■■□■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T2-T35031■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■□■□□□□■■■■■■■H3751■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□■□□□□■■■■■■■H319081■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■□■■■■■■■■■EAI52361■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■□□□□■■■■■■■H35111■■■■■■■■■■■□■□□□□□□□□□□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T12492□■■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■CAS1_DEHLI4711■■■■■■■■■■■□■■□□□□□□□□□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■□□□□□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■■■■□□■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New2■■■□■■■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■□■■■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■■■■□■■■■□□■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■■■New1■■■■■■■■□□□■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New1■□■■□■■□■□□□■□□■■■■■□□■■■■■■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■□□■□■■■□□■□■■■■■□■■■■■■■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■□□■■■■□□□■□■□■□■■■■■□■■■□□□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■□■□■□■□□■■■□■□■■■■■□■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■■■■■■■■□■■■■■■□□□□□□□□□□■□□□□■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■□■□□■□■■■□■□□■□□■■■■■□□■■■■■■■■■New1

表2 114例HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌在性別和年齡構成方面差異
Tab.2 Differences in sex and age composition ofMycobacteriumtuberculosisin 114 cases of HIV/MTB co-infection patients

人數北京家族非北京家族χ2P值性別男966630女12661.6880.194年齡20-302017331-4042251741-502517851-6016115>605235.6410.228無病例資料642

從左到右以此為：進化樹、菌株編號、SpolDB4數據中的SIT號、基因家族、Spoligotyping圖譜圖2 HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌UPGMA進化樹Fig.2 UPGMA-tree of the genotypes of Mycobacterium tuberculosis in HIV/MTB co-infection patients

3 討 論

本研究采用間隔寡核苷酸分型(Spoligotyping)技術對所收集的114例HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌臨床分離株進行了基因分型研究。結果顯示，114例結核分枝桿菌成2個大的基因家族，即北京家族(Beijing Family)和非北京家族(non-Beijing Family)，其中以北京家族菌株為主，占到66.7%。據報道，浙江(北京家族占70.0%/71.4%)[2-3]、新疆(北京家族占68.7%)、吉林(北京家族占89.5%)[7]、廣西(北京家族占55.3%)[8]、甘肅(北京家族占86.9%/87.6%)[9-10]、四川(北京家族占61.3%)[11]、北京(北京家族占85.1%)[12]、黑龍江(北京家族占89.5%)[13]、江蘇(北京家族占80.4%/81.1%)[14-15]、內蒙古(北京家族占85.5%)[16]、上海(北京家族占80.3%)[16]、山東(北京家族占85.9%)[17]、武漢(北京家族占81.9%)[18]、西藏(北京家族占90.6%)[19]、香港(北京家族占68.5%)[20]、重慶(北京家族占75.0%/66.7%)[21-22]、江西(北京家族占75.9%)[23]等全國多省市結核分枝桿菌基因分型也是以北京家族為主。另有研究對全國部分省份的結核分枝桿菌臨床分離株進行Spoligotyping基因分型，結果也顯示北京家族基因型為主要我國流行基因型[24-25]。本研究與單純感染MTB的流行菌株一致，均為北京家族菌株。北京家族菌株是由Van等在1995年首次報道的，它們具有特征性的spoligotyping指紋圖譜，即1-34間隔區缺失。目前，已經在世界范圍內發現了北京家族菌株的流行[26]。有研究指出，北京家族的產生可能是由于長期的卡介苗(BCG)接種和大量抗菌藥物使用的選擇性壓力造成，并且成功傳播[7-8]。另據 SITVIT2 數據庫統計結果顯示，全球約有1/3的結核病都是由北京家族菌株引起的，而在東亞，超過50%的結核分枝桿菌為北京家族菌株。本研究首次發現，在HIV/MTB雙重感染人群中，結核分枝桿菌主要流行株仍然為北京家族菌株。這在制定HIV/MTB雙重感染人群結核病的防控措施時，提示要重點加強對北京家族菌株的流行病學監測。此外，統計分析顯示，在HIV/MTB雙重感染病例菌群中，北京家族菌株和非北京家族菌株在性別和年齡組成方面差異無統計學意義(P>0.05)，因此，導致北京家族菌株流行的因素還有待進一步研究。

此外，在HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌基因型中，還發現有T家族(15.8%，18/114)，H家族(4.4%，5/114)，EAI5基因家族和CAS1_DEHLI基因家族(分別占0.1%，1/114)。T家族和H家族菌株是非洲、歐美地區的主要流行菌株，也是本研究中發現的第二、三大流行菌株，分別占15.8%和4.4%，它們分別來自廣東、廣西、云南、重慶、江西和湖南等省份，這也許與近年來我國與非洲、歐美地區旅游交流頻繁有關系[27-28]。EAI5基因家族和CAS1_DEHLI基因家族主要流行于中東和印度等東南亞一些國家，近年來在中國新疆等省份也有發現[29-31]。本研究發現的該家族菌株均來自廣東。此外，本研究還發現12種在數據庫中沒有對應基因家族或沒有匹配的結果的菌株，提示在HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌菌群中，可能存在新的突變基因型，但其具體分型和流行病學意義有待進一步研究。

本研究首次對HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌基因型進行了初步的研究，發現北京家族菌株為HIV/MTB雙重感染病例結核分枝桿菌菌群的主要流行菌株。同時還存在T家族、H家族、EAI5家族和CAS1_DEHLI家族菌株等其他家族的結核分枝桿菌。這對HIV/MTB雙重感染人群結核病的流行趨勢分析、防控措施制定等具有重要指導意義。

利益沖突：無