華支睪吸蟲生活史室內微生態建立

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華支睪吸蟲(Clonorchissinensis，肝吸蟲)感染人主要引起肝膽系統長期慢性炎癥反應，嚴重可致肝纖維化和膽管癌。WHO國際癌癥研究署于2009年已將華支睪吸蟲確定為膽管細胞癌明確致癌物[1]。我國是肝吸蟲病主要流行區，而廣西肝吸蟲感染率位居全國第二位[2]，近年感染率一直呈上升趨勢[3]，肝吸蟲感染已成為影響廣西公共衛生健康的重要寄生蟲病。

肝吸蟲生活史復雜，需要水環境，人是終宿主，主要保蟲宿主有貓、犬、鼠等，第一中間宿主為淡水螺類，主要有紋沼螺(Parafossarulusstriatulus)、長角涵螺(Alocinmalongicornis)和赤豆螺(Bithyniafuch-sianus)；第二中間宿主主要是鯉科魚類。而野生麥穗魚(Pseudorasboraparva)對肝吸蟲有很高易感性，常作為獲取囊蚴的供體。但若完全依靠從流行區采集麥穗魚和淡水螺來獲取實驗所需囊蚴和尾蚴，不可避免會受到季節、氣候、人力等儲多因素限制，從而影響工作的時效性和計劃性，而野外獲得的魚往往還合并感染有其它囊蚴，這又極大地增加了分離鑒定囊蚴的工作量。為滿足科研和教學工作的需求，有必要建立一個小型室內華支睪吸蟲生活史的生態環境來解決樣本的來源問題。經過三年摸索和改進，現已成功構建了一個能完成肝吸蟲生活史的生態環境。該生態占地面積小，日常維護所需人力物力少，可行性高，現將方法報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物來源 紋沼螺、麥穗魚分別采自廣西肝吸蟲流行區橫縣水庫和溝渠；雌性SD大鼠(SPF級)，160～180 g，購自本校實驗動物中心。

1.2麥穗魚飼養缸和紋沼螺飼養盆的建立和管理 取塘泥曬干備用。玻璃魚缸大小120 cm×60 cm×50 cm，分隔成3個區間，左、右兩邊寬20 cm，中間寬80 cm，水深40 cm，底部鋪塘泥厚約10 cm，種植水韭草(Valisneriaspiralis)；紋沼螺飼養盆為長方形塑料盆，2個，可直接從市場購買，大小66 cm×40 cm×18 cm，塘泥放于盆的短邊端，約占盆長度一半，厚8 cm，同樣種植水韭草，水深16 cm；另訂做一隔網，長度與盆寬度等長，寬度等同于盆高度，插在盆的底部無塘泥這端，隔出一空間用于飼養已感染的麥穗魚。24 h充氧和抽水循環，12h全光譜燈光照；在水溫低于20 ℃時，開啟加熱棒，維持水溫在24～25 ℃；每周投喂小魚飼料(市售)2～3次，每2周換水1/2，所用水為自來水，使用前先將自來水接入缸內存放3～4 d以去氯后使用。

1.3肝吸蟲蟲卵收集 收集肝吸蟲感染者糞便，采用水洗沉淀法處理后，留取沉渣。

1.4紋沼螺感染及查尾蚴 將上述收集的沉渣倒入直徑15 cm培養皿內，然后放入紋沼螺963個， 螺與蟲卵比例約1∶50，保持水面沒過螺即可，感染8 h，之后將螺連同皿內沉渣一起倒入飼養盆內，每周重復1次，連續3次。查螺時先將30個螺放入直徑6 cm平皿內，加入清水置燈下光照，查到有尾蚴時，再將螺移入直徑3.5 cm小培養皿內，一螺一皿，便可將陽性螺鑒定出來。陽性螺移入另一飼養盆內，與未受染螺分開飼養。

1.5麥穗魚感染 早上8點，取陽性螺1螺1皿，加入清水，置燈下光照，下午3點，將陽性螺放回池內。尾蚴連同皿內的水一起倒入2 000 mL燒杯內，加清水至1 000 mL刻度處，打開氣泵，調節氣量適中，放入麥穗魚，加蓋以防魚躍出，過夜。第2 d將魚連同水一起倒入飼養陽性螺的盆內隔出的養魚區間。為避免一次大量感染可能會造成魚死亡，采用單次感染的尾蚴數量每尾魚不超過3千條，隔天或每天連續感染，累積感染尾蚴總數1～2萬條。之后魚可在隔間內飼養，或移到魚缸小池內與未感染魚分開飼養，便于使用時撈捕。

1.6囊蚴活力鑒定和大鼠感染 采用人工消化法收集囊蚴。人工消化液配制： 0.9 g NaCl溶于100 mL單蒸水中，再加入1 mL濃鹽酸，混勻，最后加入0.6 g胃蛋白酶，攪拌至完全溶解。取麥穗魚，去除魚鱗、魚鰭和內臟，魚肉細細剁碎，移入三角燒杯內，按魚肉與消化液1∶10(g/mL)比例倒入人工消化液，37 ℃，慢搖消化過夜。過濾去渣，濾液倒入沉淀杯內進行水洗沉淀，反復3～5次直至上層清澈，倒掉上清液，留取沉渣置平皿內，鏡下分離囊蚴。隨機取100個囊蚴，加入0.1%胰酶，鏡下觀察計數3 min內脫囊數。用灌胃針經口感染10只SD大鼠，每鼠100個囊蚴，感染后第20 d開始取糞便查蟲卵，第50 d殺鼠計數膽管內成蟲。

2 結 果

2.1紋紹螺飼養及感染情況 2016年5月建成如圖1所示紋紹螺飼養盆，麥穗魚可飼養在放置抽水泵的這個隔間，便于捕撈，也不影響尾蚴與魚接觸。飼養陰性螺的盆則無需加此隔層。8月放入從流行區采集的963個紋紹螺，在1個月內經反復查螺確認無逸肝吸蟲尾蚴后進行蟲卵感染螺實驗，于12月開始陸續查到陽性螺，至次年5月共計47個，感染率約4.9%(47/963)。每次逸出的尾蚴數量不定，有時多達數千條，有時僅數十條，沒有規律可循。螺飼養至第2個月即觀察到有少量幼螺，全年都有產卵孵化幼螺行為。

2.2麥穗魚飼養和感染情況 2014年5月先建成魚缸，10月放入麥穗魚48條，開始半年，每月有1～2條魚死亡，之后穩定，極少死亡。第2年6月觀察到有小魚出生，魚群數量維持在40條左右(圖2)。單獨觀察了3條麥穗魚最后形成的囊蚴數與用于感染的尾蚴總數之比，分別是30.93%(928/3 000)、27.95%(1677/6 000)、32.35%(2912/9 000)，平均30.65%。麥穗魚體內囊蚴數量達8千至1萬時，魚仍能正常存活。隨機取100個囊蚴，加入0.1%胰酶，均能在3分鐘內脫囊，顯示囊蚴的活力很好。SD大鼠于感染后第23 d首次查見蟲卵，第28 d全部查到蟲卵，第50 d殺鼠獲得成蟲數為57.8±17.1條。

圖1 紋沼螺飼養盆Fig.1 Basin for breeding Parafossarulus striatulus

圖2 麥穗魚飼養缸Fig.2 Aquarium for breeding Pseudorasbora parva

3 討 論

麥穗魚體形小，喜淺水，養殖時不需要提供大體積水體，極大節省空間。該魚雖為野生，但較易訓化為室內養殖，從目前來看其壽命至少有3年以上，最重要的是對肝吸蟲囊蚴高度易感且耐受性高，囊蚴達數千至上萬仍不會致死，極適合用做肝吸蟲生活史生態池中第二中間宿主的動物模型。我們在橫縣流行區采集的螺以紋沼螺占大多數，豆螺數量較少。

曾將幾十個豆螺放在盆內飼養，養殖條件與紋沼螺相同，但未能繁殖起來。紋沼螺壽命1年半左右，當年下半年采集回來的成螺或老螺，養至次年下半年大部分螺包括陽性螺都將陸續死亡，因此用蟲卵感染螺的工作每年都需要做，用以補充死掉的陽性螺。如果螺的繁殖數量不夠多，還是需要從野外采集部分回來補充。

梁熾[4]報道的飼養池占地面積大，日常維護所需工作量也大，不易做成；程榮聯[5]報道的是一個建于樓頂戶外型飼養池，受季節影響，不適合冬季時間長，氣溫寒冷地區。本次建立的生態環境為室內，占地極小，放在實驗室角落即可，日常維護所需工作量不多，冬季通過加熱棒加溫，可不受季節影響。

不同于上述梁和程的報道，本模式將螺與魚分開飼養，螺另置于一小水體飼養，除了便于對螺進行觀察和操作外，還能避開魚和螺共養時帶來的魚對螺的攻擊。為提高蟲卵感染紋沼螺和尾蚴感染魚的感染效率，不能完全依賴在飼養環境中的自然感染，通過一些人為操作來增加螺吞食蟲卵和尾蚴接觸魚的機會也是需要的。本模式中螺感染率約為4.9%，離我們的預期還是有一定差距，如何提高螺感染率又不增加其死亡，還需要進一步探索。

利益沖突：無