副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素抑制人肺腺癌細胞活性的研究

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生物毒素抗腫瘤來源于“以毒攻毒”這個說法，生物毒素固然有害，但也可以用于治病，許多科學家從不同的生物比如蛇、蜂、相思子、炭疽等里面提取毒素并用于腫瘤的治療，這已經成為一種治療癌癥的新手段[1]。

耐熱直接溶血毒素(Thermostabile direct hemolysin，TDH) 來源于能夠引起人急性腸胃炎，傷口感染和敗血癥及海鯛、對蝦、九孔鮑、文蛤等水生動物疾病的副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,Vp),是一種分布較廣的細菌毒素[2]。TDH 蛋白是由兩條相同的多肽鏈構成的、分子量為 42 kDa 的二聚體毒素蛋白[3]。其每條多肽鏈由165 個氨基酸殘基構成，在近C 端有一個二硫鍵，呈神奈川陽性[4]。研究發現TDH 具有強烈的肝臟毒性、溶血活性、腸毒性、小鼠的致死性、心臟毒性[5-7]。

本文以試驗室自己制備的高純度TDH毒素蛋白，通過比較TDH對不同細胞的細胞毒性作用說明TDH對腫瘤細胞的毒性遠大于正常細胞。不同劑量、不同時間處理人肺腺癌細胞SPC-A-1細胞, 通過生長曲線和“創傷”試驗評價TDH在體外對腫瘤細胞生長、增殖及遷移的影響，進一步用流式細胞法和熒光試劑盒檢測TDH對SPC-A-1細胞凋亡和caspase-3活化的影響，以探討其體外抑制肺腺癌細胞的機理，以期為海洋來源的生物毒素—TDH抗腫瘤的基礎研究和應用研究提供科學的資料和依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 致病性副溶血弧菌ATCC33846 (標準菌株)購于北京中原公司；DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75層析柱購自上海思吉生物制品有限公司；Annexin V細胞凋亡試劑盒購自BD pharmingentm公司；Caspase-3熒光檢測試劑盒購自KeyGEN BioTECH公司；人肺腺癌細胞SPC-A-1、人結腸上皮細胞NCM460、人肝成纖維細胞LO2由華東理工大學藥學院劉建文教授惠贈； BSA (牛血清蛋白)購于上海正極生物有限公司；DMEM培養基、RPMI1640、胎牛血清均購于上海普飛生物有限公司。快速吉姆薩染液購于生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1TDH的制備及純化 37 ℃條件下對致病性副溶血弧菌ATCC33846進行搖床擴大培養16 h，8 000 r/min離心取上清去掉菌體，硫酸銨鹽析提取粗蛋白，然后依次經過DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75層析純化TDH[8]，將純化后的TDH 100 ℃，水浴加熱10 min，與用PBS緩沖液制備的小鼠的紅細胞懸液進行反應，通過紅細胞的裂解情況檢測純化后TDH的溶血活性， 用非變性凝膠電泳檢測純度，冷凍干燥。

1.2.2TDH的細胞毒性試驗 取對數生長期的SPC-A-1細胞，人結腸上皮細胞NCM460、人肝成纖維細胞LO2，用含5%小牛血清的DMEM培養基制成細胞懸液，以5 000細胞/孔的密度接種于96孔板，每孔體積為100 μL，于37 ℃，5% CO2的培養箱中孵育，等細胞貼壁后。用不同濃度的TDH(0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL)分別處理，每組設5個復孔，在培養箱中孵育24 h。24 h后每孔加入10 μLMTT(濃度為5 mg/mL)，繼續孵育4 h，終止培養，棄去上清液，每孔加100 μL DMSO，置搖床上振蕩10 min，使沉淀充分溶解，最后以570 nm為檢測波長，655 nm為參考波長用酶標儀測定各孔光吸收值。用改良寇氏法計算出每株細胞的半抑制劑濃度IC50。

改良寇氏法：LogIC50=Xm-I*(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm：Log最大藥物劑量，I：Log(最大藥物劑量/相鄰劑量)，P：陽性反應率之和，Pm：最大陽性反應率，Pn：最小陽性反應率

1.2.3生長曲線 取對數生長期的SPC-A-1細胞，用含5%小牛血清的DMEM培養基制成細胞懸液，以3000細胞/孔的密度接種于96孔板，每孔體積為100 μL，于37 ℃，5% CO2的培養箱中孵育，等細胞貼壁后。用不同濃度的TDH(0、0.5、1、2、3、4 μg/mL)分別處理，每組設5個復孔，在培養箱中連續孵育9 d。不同時間在相應的孔中加入10 μL MTT(濃度為5 mg/mL)，繼續孵育4 h，終止培養，棄去上清液，每孔加100 μL DMSO，置搖床上振蕩10 min，使沉淀充分溶解，最后以570 nm為檢測波長，655 nm為參考波長用酶標儀測定各孔光吸收值。以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.4“創傷”試驗 取對數生長期的SPC-A-1細胞，制備單細胞懸液，以1×105細胞/mL接種于24孔培養板，每孔1 mL。置37 ℃，5% CO2的培養箱中孵育，到細胞長成單層后，用200 μL的塑料槍頭造一道劃痕，用PBS清洗1遍，顯微鏡拍照，并用目鏡測微尺(用鏡臺測微尺校正)測量劃痕寬度后，每孔加入一定濃度的藥物(4、2、1、0.5 μg/mL)處理，每濃度平行3孔，對照組加等量體積的培養液，孵育48 h，用目鏡測微尺測量劃痕寬度[9]。

細胞遷移的距離=藥物處理前的劃痕寬度-藥物處理后的劃痕寬度/2

1.2.5細胞凋亡試驗 用 BD pharmingentm提供的試劑盒測定Annexin V染色測定細胞凋亡。取對數生長期SPC-A-11×105細胞/mL接種于細胞培養板后，孵育過夜，然后將5-FU或TDH加入培養孔中。處理24 h后，用胰酶消化，離心后加入培養基制成單細胞懸液。在100 μL細胞懸液中加入Annexin V試劑100 μL，孵育20 min后在室溫下進行分析，通過Accuri C6流式細胞儀檢測不同處理組SPC-A-1細胞的凋亡情況，采用數據分析軟件csampler BD進行數據處理。

1.2.6caspase-3活性試驗 取對數生長期的SPC-A-1細胞，以1×105細胞/mL接種于6孔板，置37 ℃，5% CO2濃度的培養箱中孵育12 h，每孔加入1 mL的5 μg/mL的TDH處理不同時間，設陰性對照，收集細胞。加入100 μL冰冷的細胞裂解緩沖液(使用前每50 μL 細胞裂解緩沖液加入0.5 μL DTT)，吹打均勻；置冰上裂解20 min，其間渦旋振蕩3次，每次10 s。4 ℃，10 000 r/min離心1 min后，小心吸取上清轉移至新的管中，并放置冰上待用；取少量上清(1～2 μL)，Braford法測定蛋白濃度。按照說明書吸取30 μL含100～200 μg蛋白的細胞裂解上清，依次加入反應緩沖液，ddH2O以及加入Caspase-3底物反應液，并于37 ℃避光孵育1.5 h；用熒光酶標儀測定熒光強度(激發波長=485 nm，發射波長=535 nm)。通過計算TDH處理組比陰性對照組平均熒光強度的倍數來確定TDH處理組Caspase-3活化程度。以10 mmol/L PBS和反應緩沖液 作為空白對照。

2 結 果

2.1TDH的純化 經過一系列層析后得到的TDH樣品進行進行溶血活性檢測，用PBS緩沖液和沒有進行加熱處理的TDH作為對照，經過加熱處理后有活性的樣品孔內沒有紅細胞沉淀，將這部分洗脫液進行合并濃縮得到最后的樣品，結果見圖1，非變性凝膠電泳顯示單一條帶，見圖2。說明本試驗中得到的TDH是具有活性并且純度較高的，該樣品冷凍干燥。使用前，溶解于少量pH7.4 , 0.01 mol/L的PBS或者培養基中。

a：PBS對照組；b：TDH對照組；c、d、e：TDH加熱組圖1 TDH洗脫液的溶血活性測定Fig.1 Determination of hemolytic activity of TDH eluent

1. 分子量marker; 2. TDH圖2 純化后的TDH非變性SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Non denatured SDS-PAGE electrophoresis of purified TDH

2.2TDH的細胞毒性試驗 不同濃度TDH處理 SPC-A-1細胞、NCM460細胞、LO2細胞，對其半抑制劑濃度IC50的影響見表1。從試驗結果可以看出：正常細胞的IC50高出肺腺癌細胞近20倍，由此可見TDH對腫瘤細胞的毒性遠大于正常細胞，對腫瘤細胞具有選擇性。

2.3TDH對 SPC-A-1細胞生長曲線的影響 不同濃度TDH處理 SPC-A-1細胞，對其生長曲線的影響見圖3。從試驗結果可以看出：TDH劑量依賴性抑制SPC-A-1細胞的生長, 與對照組相比，TDH明顯減緩了SPC-A-1細胞生長對數期，使斜率壓低，縮短了平臺期，加速了衰亡期。

表1 TDH對不同細胞的半數抑制量
Tab.1 Half maximal inhibitory concentration of different cells treated by TDH

細胞IC50(μg/mL)SPCA16.7NCM460151LO2118

圖3 TDH對SPC-A-1細胞生長的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of TDH on the growth of SPC-A-1 cell

2.4TDH對 SPC-A-1細胞遷移能力的影響 不同濃度TDH處理 SPC-A-1細胞，對其遷移能力的影響見圖4。試驗結果可以看出：隨著TDH濃度的增大，SPC-A-1細胞移動的距離越來越小，呈劑量依賴性。說明TDH可以抑制SPC-A-1細胞的遷移。

與對照組比較 *P<0.05， **P<0.01圖4 TDH對SPC-A-1細胞移動能力的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of TDH on the migration of SPC-A-1 cell

2.5TDH對 SPC-A-1細胞凋亡的影響 Phosphatidyl serine(PS)通常是定位在質膜的脂質雙層膜的內表面。當細胞凋亡時，PS是外翻的、可由Annexin V-FITC檢測。因此，膜聯蛋白可作為程序性細胞死亡的標志物。TDH處理24 h后誘導SPC-A-1細胞凋亡顯著增加(早期)(圖5)。正常對照組，陽性對照組5-Fu (20 μg/mL)，5 μg/mL TDH處理組SPC-A-1細胞的凋亡率分別為2.40%、53.20%和33.30%，在5-FU和TDH處理組分別表現出51.9%和33%的早期凋亡事件。因此，我們認為，細胞凋亡是TDH引起SPC-A-1細胞死亡的重要作用機制。

a：陰性對照； b：陽性對照組；c：TDH 處理組圖5 TDH誘導SPC-A-1細胞凋亡的作用Fig.5 Effect of TDH on inducing apoptosis of SPC-A-1 cell

2.6TDH對caspase-3活性的影響 5 μg /mL的 TDH處理SPC-A-1細胞后，分別在1, 1.5, 2, 2.5h檢測 caspase-3的活性，發現隨著時間的延長，caspase-3的活性逐漸增加(圖6)。

與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01圖6 5 μg /mL TDH對SPC-A-1細胞caspase-3的激活Fig.6 Activation of Caspase-3 in SPC-A-1 cell by TDH (5 μg /mL)

3 討 論

細菌毒素是天然毒素的一種，指微生物產生的具有自身防衛作用的各種物質。近年研究發現，細菌毒素不僅具有毒理作用，也具有藥理作用，可作為天然來源的抗腫瘤藥物,是新型藥物開發的重要研究靶標，是近年來興起的用于癌癥治療的新思路[10]。許多細菌毒素都是與配體融合然后結合到腫瘤細胞上發揮作用,因此免疫毒素一般設計成配體或抗體與細菌毒素融合的嵌合蛋白,從而定位到特異的靶標細胞上發揮作用,如YangX等將白喉毒素的催化兼移位區域(提供靶向和毒性作用)和人表皮生長因子融合成新蛋白在體內和體外均有良好的抗腫瘤活性，并且在小鼠體內沒有顯示出任何非特異性全身毒性[11]。一個包含白細胞介素2和白喉毒素片段的融合毒素被批準用于T淋巴細胞瘤的治療[12]。以上研究提示，細菌毒素對多種腫瘤有較好療效,且能克服傳統癌癥療法的缺陷,在癌癥治療中具有重要價值和應用前景。

近年來的研究表明：副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素(TDH)可抑制結直腸癌細胞系的增殖，顯示出一定的抗腫瘤活性[13]。本試驗測得在TDH處理人的結腸上皮細胞NCM460、人肝成纖維細胞LO2 、人肺腺癌細胞SPC-A-1 24h之后，細胞的半抑制劑濃度IC50分別為151μg/mL、 118μg/mL和6.7μg/mL。通過TDH對不同細胞的細胞毒性比較，兩株人的正常細胞的IC50比SPC-A-1高出近20倍，由此可知，TDH對腫瘤細胞的毒性遠大于正常細胞，對腫瘤細胞具有選擇性。本試驗研究發現:經純化后的TDH處理人肺腺癌細胞SPC-A-1 24h，結果顯示：TDH劑量依賴性抑制SPC-A-1細胞的生長，能減緩細胞生長的對數期、縮短平臺期，促進衰亡期。圖2和圖3可以看出：TDH能明顯抑制SPC-A-1細胞的克隆形成及遷移能力。據報道，癌細胞的克隆形成能力與癌細胞的增殖能力和轉移能力密切相關[14]，而癌細胞的遷移能力在癌細胞的轉移過程中起關鍵作用。進一步，流式細胞儀研究采用膜聯蛋白V染色法，它反映了細胞可能死亡的兩種截然不同的方式：凋亡和壞死途徑。大部分潛在的抗腫瘤藥物會通過誘導細胞凋亡而殺傷細胞[15]。5μg/mLTDH顯示出33%細胞凋亡，明顯高于正常對照細胞凋亡率，說明細胞死亡是通過細胞凋亡途徑介導。進一步的研究表明：TDH能誘發caspase-3的活化，說明TDH可能通過激活caspase-3誘導了細胞的凋亡。在哺乳動物細胞中，caspase-3依賴性的細胞凋亡通過兩條途徑引發：細胞表面的死亡受體起始的外源性途徑或者線粒體起始的內源性途徑[16-17]。進一步的試驗需要探明TDH是通過其中哪一條途徑誘導凋亡的機理。

總之，本研究說明TDH可以有效地抑制SPC-A-1細胞的生長、增殖及體外轉移能力可能與TDH激活caspase-3而誘導細胞凋亡有關，提示TDH可能是一種潛在的治療人肺癌的生物治療方法。TDH在體內對腫瘤細胞的抑制及其作用機制的研究將在后續試驗中進一步研究。

利益沖突：無