布魯氏菌鞭毛研究進展

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布魯氏菌是一種兼性胞內病原體，能夠引發人畜共患病-布魯氏菌病，因為布魯氏菌具有高度的傳染性，能夠通過空氣進入呼吸道傳播，且初始癥狀容易與流行性感冒相混淆，是潛在的生化武器，被我國列為乙類傳染病。自上世紀90年代以后，由于多種因素的影響，我國布魯氏菌病呈現出明顯上升的發病趨勢，流行范圍呈現明顯的擴散趨勢[1]，探究布魯氏菌毒力機制，研發布魯氏菌人畜疫苗是未來的研究重點[2]。布魯氏菌之前被認為無鞭毛，直到近幾年電鏡技術的發展才確定它的存在，并已有一些研究證實其有構成布魯氏菌毒力，作為疫苗候選的潛在可能性。

布魯氏菌病發病機制主要與布魯氏菌入侵宿主細胞并在其胞內存活和復制有關[3-4]。在布魯氏菌侵入宿主細胞并在宿主細胞內生存繁殖的過程中，多種毒力因子相互協調發揮保護細菌免受機體免疫系統殺傷的作用，布魯氏菌鞭毛在其中發揮的作用值得進一步的研究。

1 布魯氏菌鞭毛的發現

細菌的鞭毛是從菌體伸出的細長的絲狀物。它使細菌能更好地適應環境，是細菌在進化過程中長期適應的結果。它既是一個運動器官，又是一個蛋白質轉運/組裝裝置。它由3個部分組成，包括基體(Basal body)、鉤型鞘(Hook)和鞭毛絲(Flagellar filament)[5]。

關于鞭毛的研究通常建立在細菌運動性的基礎上，而布魯氏菌并無運動特征也是布魯氏菌一直以來被認為無鞭毛的原因之一。1998年Halling發現牛種布氏菌含有幾種鞭毛相關蛋白同源物的開放閱讀框[6]，2002年DelVecchio和Paulsen等人的研究發現布魯氏菌具有趨化基因外所有鞭毛結構基因，組成3個基因座，并與苜蓿中華根瘤菌具有廣泛的基因同源性[7-8]，這些基因位于小染色體上。

2005年D.Fretin等人一方面構建了包含鞭毛基因fliF啟動子的質粒，通過β-半乳糖苷酶測定法驗證布魯氏菌侵染巨噬細胞過程中鞭毛基因fliF基因的瞬時表達；另一方面對從羊種布氏菌獲得的全細胞提取物進行蛋白質印跡分析，在布魯氏菌指數增長期早期檢測到布魯氏菌鞭毛鉤蛋白fliE和鞭毛蛋白fliC的表達[9]。從這兩方面可以看出布魯氏菌鞭毛基因、蛋白質或鞭毛器并非不表達，其表達依賴于生長期，透射電鏡下觀察其鞭毛屬單一極性鞭毛，同副溶血弧菌一樣在鞭毛表面包裹著一層鞘膜，有研究發現此鞭毛與布魯氏菌毒力相關，并在布魯氏菌持續感染中有不可或缺的意義[10-11]。

2 布魯氏菌鞭毛染色及鏡下觀察

作為細菌的運動器官，鞭毛的數量、形態和它在菌體的分布位置是鑒定細菌的重要指標，但由于它的直徑非常纖細，必須采用特殊的染色方法才能在顯微鏡下觀察到。常見的細菌鞭毛染色方法包括賴夫生染色法、西薩-基爾染色法、銀鹽染色法、柯達卡溶液染色法及負染法。需要注意的是：布魯氏菌僅在早期指數生長期才能觀察到鞭毛，并且對培養基的營養需求較高(國外研究證實在2YT培養基中培養可實現)[12]。

根據報道，Ryu染色法可觀察到布魯氏菌鞭毛。方法如下：將10 mL 5%苯酚水溶液、2 g單寧酸和10 mL飽和硫酸鋁鉀-12水合物制成媒染劑；將結晶紫的飽和乙醇溶液(25 g 95%乙醇中的3 g)制成染色劑；之后將媒染劑與染色劑以1∶10混合并過濾得到最終的RYU著色劑；將1滴細胞培養物轉移到載玻片上，蓋上蓋玻片；5～10 min后將2滴Ryu染色劑施加到蓋玻片的邊緣通過毛細管作用流動到蓋玻片下面并與細胞懸液混合；室溫5～10 min后在相差顯微鏡下觀察細菌鞭毛[12-13]。相差顯微鏡下結果見圖1[12]。

圖1 布魯氏菌及其鞭毛相差顯微鏡結果Fig.1 Brucella and its flagella under the phase-contrast microscopy

透射電子顯微鏡(TEM)能看到光學顯微鏡下無法看清的結構(亞顯微結構)，適合布魯氏菌鞭毛觀察，觀察方法如下：細菌在37 ℃的豐富培養基培養至OD600nm處為0.25的狀態，1 000 r/min離心20 min，得沉淀用PBS懸浮，之后應用醋酸鈾負染法于透射電鏡下觀察。透射電鏡鏡下結果見圖2[12]。

圖2 布魯氏菌及其鞭毛電子顯微鏡結果Fig.2 Brucella and its flagella under the transmission electron microscopy

3 布魯氏菌鞭毛基因測序及其表達調控

經基因組測序發現，布魯氏菌具有除趨化基因外所有鞭毛結構基因，并被認為屬于隱性遺傳物。不同布魯氏菌屬的幾種鞭毛基因中存在變異，將對揭示布魯氏菌遺傳進化過程有指導作用[14-16]。

在2005年D.Fretin等人的研究發現布魯氏菌鞭毛基因在早期生長指數期可以表達，并通過透射電子顯微鏡TEM觀察到由LPS軸承護套包圍的完整極性鞭毛結構[9]。多種基因參與布魯氏菌鞭毛生成。在2007年S.Leonard和J.Ferooz等人的研究中羊種布魯氏菌ftcR作為鞭毛的主調節因子發揮作用，是vjbR調節鞭毛系統的中間環節，ftcR具有雙組份響應調節結構域以及DNA結合結構域，并被編碼在羊種布魯氏菌的第一鞭毛位點，在ftcR失活的情況會導致鞭毛基因表達下降和布魯氏菌毒力受損[17]。在之后2011年J.Ferooz驗證了fibT基因在鞭毛蛋白flic生成中的作用。而sigma因子rpoE1的突變則會引起鞭毛基因fliF,flgE,fliC,flaF和fibT的過表達，與鞭毛長絲的產生相關，驗證了rpoE是一個鞭毛阻遏基因。而rpoE1的突變會增加鞭毛主調節因子ftcR的啟動子活性。這表明rpoE1上層調控ftcR[18]。鞭毛表達受一系列基因調控，具有復雜的調節機制。

4 布魯氏菌鞭毛與毒力

常規認為鞭毛及其運動功能可促進細菌對于宿主細胞的黏附與侵襲，在細菌生物被膜形成過程中起重要作用，與細菌毒力因子的分泌也密切相關。有研究表明費氏弧菌可通過鞭毛的旋轉調節外膜蛋白釋放，從而影響毒力[19]。布魯氏菌與費氏弧菌皆為單極鞘鞭毛，有一定的參考價值。另外布魯氏菌毒力的一個重要方面是其在感染細胞內的存活，復制和持續的能力。當前對布魯氏菌鞭毛毒力的探索建立在細胞實驗和動物實驗之上。在體外實驗層面，D.Fretin等人構建鞭毛基因突變體，并與野毒株共同侵襲細胞，比較其細胞侵襲及胞內復制的能力，觀察一定時間后菌落形成單位結果顯示無明顯差別；2013年Matthieu Terwagne等人的研究顯示同樣的結果[10]。

在動物實驗層面，D.Fretin等人研究顯示布魯氏菌鞭毛突變體在小鼠中減毒，通過構建鞭毛基因突變體，并與親本株一起感染小鼠感染初期無明顯差別，感染后期感染突變體小鼠平均脾重顯著低于親本株感染小鼠，提示羊種布氏菌在小鼠中的持續感染需要鞭毛結構的表達[9]。而Matthieu Terwagne等人的研究顯示過表達鞭毛蛋白fliC菌株在小鼠中減毒，同樣條件fliC缺失株增強了羊種16M菌株在體內毒力的持續性。

布魯氏菌鞭毛蛋白對毒力的影響較為復雜，尚需進一步的研究。

5 布魯氏菌鞭毛與免疫“逃避”策略

有研究表明，布魯氏菌使用被動以及主動機制來逃避先天性免疫系統的TLR檢測。布魯氏菌鞭毛蛋白TLR5活性的缺乏以及其對宿主細胞的合成或遞送的調節都是布魯氏菌對先天免疫系統的隱身策略的一部分[10]。盡管鞭毛蛋白逃避TLR5的檢測，但仍可引起胞質模式識別受體PRRs的檢測進而啟動免疫應答。鞭毛蛋白引起的固有免疫可以破壞布魯氏菌進入宿主時的“隱身”能力，在這種情況下，鞭毛蛋白可被認為是“宿主保護因子”[20]。

實際上，布魯氏菌對于宿主免疫系統來說并非完全不可見，它們仍然可以檢測到它們并形成TH1應答來控制感染。然而，宿主免疫應答不足以消除細菌，導致以病原體毒力和宿主抗性之間的平衡為特征的慢性感染狀態。TLR5和NLRC4/NAIP5復合物被視為目前唯一胞外/胞質細菌鞭毛蛋白先天免疫傳感器的蛋白質。通過逃避TLR5介導的檢測，布魯氏菌獲得一定程度的“隱身”。布魯氏菌fliC是第一個發現以NLRC4獨立方式體外誘導巨噬細胞分泌IL-1β的鞭毛蛋白。通過鞭毛蛋白激活先天性免疫途徑來限制體內布魯氏菌的復制將成為應對布魯氏菌病的一種新方法。

6 布魯氏菌鞭毛免疫原性與群體感應

鞭毛蛋白作為革蘭氏陰性菌的主要結構蛋白，是TLR5的配體和寡聚核酸區域(NOR)末梢感受器(NLR)家族的固有感受器。當它通過不同方式以共價鍵與抗原結合時展現出強大的免疫原性[19]。因此，鞭毛蛋白已經作為疫苗研制的新平臺成功應用于各類菌株。例如幽門螺桿菌、愛德華氏菌等多種病菌[20-21]。鞭毛蛋白可作為各種細胞類型先天和適應性免疫的有效激活劑。有研究證明布魯氏菌鞭毛蛋白有著促進一系列先天細胞免疫類型的細胞因子產生的能力。2012年研究發現在其檢測范圍內，5種布魯氏菌鞭毛蛋白可刺激來自S19免疫小鼠的脾細胞中顯著更高水平的IFN-γ分泌，表明其具有T細胞誘導活性。

細菌通過群體感應系統自發產生、釋放一些特定的信號分子，并能感知其濃度變化，調節微生物的群體行為。雖然每種革蘭氏陰性菌所產生的的群體感應機制不同，但其調控蛋白具有高度同源性，目前研究到大多數革蘭氏陰性菌都存在名為LuxI-AHL型的群體感應系統，有研究證明布魯氏菌鞭毛基因作為布魯氏菌潛在毒力因子，受群體感應系統調控。VjbR是LuxR家族的群體感應調節因子，可以調節fliF和figE基因的表達[11, 22]。

7 布魯氏菌鞭毛蛋白展望

通過構建鞭毛蛋白和保護性抗原結合后的融合蛋白，由此方法已經產生許多證明有效的動物疫苗。布魯氏菌鞭毛蛋白具有一定免疫原性，已有研究證明其通過添加佐劑可作為布氏菌病疫苗候選[21, 23]，但要注意鞭毛蛋白融合蛋白的長期儲存可能導致形成以TLR5非依賴性方式起作用的大聚集體，類似動態光散射的方法是確保鞭毛蛋白和鞭毛蛋白融合蛋白是單體且不聚集的有效手段[24]。

目前對布魯氏菌鞭毛蛋白的研究尚處于初級階段，其出現的確切時條件，對布氏菌隱身策略乃至毒力的影響等方面尚無定論，而其在毒力探索及疫苗研制方面所起的作用確有研究價值，值得進一步的研究。

利益沖突：無