基于PCR檢測和基因測序分析的鹿源副結(jié)核分枝桿菌鑒定及亞型分型

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副結(jié)核病(paratuberculosis)也稱Johne’s disease，其病原是禽分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacteriumaviumsubsp.paraenberculosis，MAP)。該菌可引起反芻獸慢性消耗性傳染病，臨床特征主要表現(xiàn)為慢性卡他性腸炎、頑固性腹瀉和進行性消瘦，病理學(xué)特征為慢性增生性腸炎，剖檢可見腸黏膜增厚并形成皺襞[1]。反芻動物如牛、綿羊、山羊、駱駝和鹿對本菌易感。副結(jié)核病是一種人獸共患慢性感染性疾病，不僅對養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，同時也對公共衛(wèi)生安全造成威脅。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類疫病，我國被列為二類動物疫病。

由于大多數(shù)情況下，感染副結(jié)核病的馬鹿處于亞臨床狀態(tài)，即不表現(xiàn)出明顯臨床表現(xiàn)，或癥狀不典型。因此，僅通過臨床診斷來判斷馬鹿是否感染副結(jié)核病就存在一定的局限性。目前，細(xì)菌分離培養(yǎng)法是當(dāng)今世界上推薦的活體定性最準(zhǔn)確和可靠的方法，由于初代分離極為困難，檢出率低，亞臨床感染的動物糞便采用培養(yǎng)方法可能不能獲得該菌，易導(dǎo)致試驗結(jié)果假陰性，且耗時、費用高，在群體檢測中的應(yīng)用受到很大限制。相比較細(xì)菌學(xué)診斷、變態(tài)反應(yīng)診斷、血清學(xué)診斷，PCR方法能及早診斷、縮短檢測時間、特異性高，是目前診斷副結(jié)核病最為快捷的方法[1]。

馬鹿是我國重要的經(jīng)濟動物和野生動物，副結(jié)核病已成為危害養(yǎng)鹿業(yè)重要傳染病之一，直接或間接造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。因此，開展馬鹿副結(jié)核病研究對疫病防控具有重要意義。鑒于副結(jié)核分枝桿菌進行常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定耗時長、亞型無法確定的特點，本研究采用PCR檢測和基因測序分析技術(shù)，結(jié)合臨床觀察、病理觀察，對新疆某規(guī)模鹿場疑似感染副結(jié)核病樣品進行PCR病原鑒定，為該病的診斷、防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1樣品采集無菌采取新疆某地養(yǎng)鹿場編號為34T-44號、34T-45號的病死馬鹿的腸系膜淋巴結(jié)、小腸樣品。其中，用于組織觸片抗酸染色的小腸組織進行冷藏保存，用于DNA提取的腸系膜淋巴結(jié)冷凍保存，用于病理組織切片檢查的小腸樣品保存于4%多聚甲醛固定液。

1.1.2主要試劑血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、pGM-T克隆試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、TIANgel Midi Purification Kit試劑盒等均購于天根生化科技(北京)有限公司。抗酸染色試劑、4%多聚甲醛固定液，由本實驗室配制保存。

1.1.3儀器PCR儀(TC-5000，購自英國TECHNE公司)，小型高速冷凍離心機(Centrifuge 5415R，購自Eppendorf公司)，電泳儀(Thermal cycler Block，購自Thermo Fisher公司)，凝集成像儀(Gel DocTM XR+，購自Bio-RAD公司)。

1.2 方 法

1.2.1發(fā)病調(diào)查新疆某養(yǎng)鹿場部分馬鹿出現(xiàn)持續(xù)性腹瀉，發(fā)病馬鹿經(jīng)抗生素治療病情有所緩解，過數(shù)日后再次出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象。發(fā)病馬鹿年齡多在1.5～3歲之間，舍飼隔離管理。部分馬鹿失去生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

1.2.2臨床癥狀發(fā)病馬鹿表現(xiàn)消瘦、精神萎靡，食欲減退，被毛粗亂、無光澤。糞便呈稀糊狀或稀液狀并帶有惡臭味，糞便中有的帶有灰白色粘液或脫落的粘膜。經(jīng)治療后腹瀉癥狀有減緩或停止，但經(jīng)數(shù)日再次復(fù)發(fā)。

1.2.3病理變化剖檢2只發(fā)病死亡馬鹿(編號34T-44、34T-45)，皮下水腫，局灶性膠凍樣浸潤，腸系膜淋巴結(jié)腫大，呈條索狀，質(zhì)地柔軟，切面外翻、濕潤，腸系膜水腫、增厚，呈膠凍樣。回腸、空腸、盲腸體、回盲瓣部位黏膜增厚。

1.2.4 實驗室檢查

1.2.4.1細(xì)菌學(xué)檢查取病變明顯的小腸黏膜組織做觸片，萋-尼氏法抗酸性染色，鏡檢觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4.2病理組織學(xué)檢查取4%多聚甲醛溶液中組織塊(小腸)，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、石蠟切片、萋-尼氏法抗酸染色法，鏡檢組織學(xué)病理變化、染色特性。

1.2.4.3PCR鑒定取34T-44、34T-45馬鹿冷凍保存的腸系膜淋巴結(jié)，研磨，反復(fù)凍融3次，依照說明書操作提取DNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

副結(jié)核分枝桿菌的IS900鑒定引物來源于參考文獻[2]，IS900分子鑒定引物序列如下P90：5′-GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3′，P91：5′-GAGGTCGATCGCCCACGTGA-3′，預(yù)計擴增片段為400 bp。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Go Tap Green Master Mix 12.5 μL，引物Primer90、Primer91各0.5 μL，模板DNA 2.5 μL，ddH2O 9 μL混勻后瞬時離心。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；93 ℃變性1 min、58 ℃退火1 min、72 ℃延伸3 min，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收、克隆、測序與分析。

副結(jié)核分枝桿菌的亞型鑒定亞型鑒定的特異性引物來源于文獻[3]， DMC529：TTGACAACGTCATTGAGAATCC； DMC531：TCTTATCGGACTTCTTCTGGC；DMC533：CGGATTGACCTGCGTTTCAC。Ⅱ亞型分型擴增片段310 bp，Ⅰ亞型分型擴增片段146 bp。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Go Tap Green Master Mix12.5 μL，引物Primer90、Primer91各0.5 μL，模板DNA 2.5 μL，ddH2O 9 μL混勻后瞬時離心。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收、克隆、測序與分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌學(xué)檢查 萋-尼氏法抗酸性染色鏡檢在被檢樣品中存在抗酸染色陽性的桿狀菌體(紅色)，見圖1。

2.2病理組織學(xué)檢查 4%多聚甲醛溶液固定的回腸組織作常規(guī)病理組織學(xué)切片、萋-尼氏法抗酸性染色，鏡檢觀察可見回腸粘膜下層抗酸染色陽性區(qū)域(紅色)，見圖2。

圖2 小腸病理組織切片抗酸性染色(10×40)Fig.2 Anti-acid staining of pathological tissues lice of small intestine(10×100)

2.3PCR擴增 34T-44、34T-45樣品經(jīng)提取總DNA，用副結(jié)核分枝桿菌IS900分子鑒定引物作PCR擴增，電泳得到400bp大小的片段，與預(yù)期的目的片段大小相符(圖2)。

注：M：DNA Marker DL2000；1：空白對照；2：34T-44 PCR擴增片段.3: 34T-45 PCR擴增片段圖3 副結(jié)核分枝桿菌IS900基因PCR鑒定Fig.3 Identification of IS900 gene PCR amplification of M. avium subsp. paraenberculosis

對34T-44、34T-45樣品采用DMC529、DMC531、DMC533亞型分型引物作PCR擴增，得到310 bp大小的片段，與Ⅱ型分型基因片段的預(yù)期大小一致(圖3)。

注：M：DNA Marker DL2000；1：空白對照；2：34T-44 PCR擴增片段.3: 34T-45 PCR擴增片段圖4 副結(jié)核分枝桿菌亞型PCR鑒定Fig.4 Subtype identification of M. avium subsp. paraenberculosis by PCR

2.4IS900基因核苷酸同源性比較及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 應(yīng)用DNAstar軟件，34T-44、34T-45序列與副結(jié)核分枝桿菌參考序列進行IS900基因核苷酸同源性比較(見表1)。結(jié)果顯示，34T-44、34T-45與參考株同源性均在99%以上。34T-44、34T-45兩者之間同源性為100%。從而確定34T-44、34T-45樣品為副結(jié)核分枝桿菌。

表1 34T-44、34T-45與參考株IS900基因核苷酸同源性比較
Tab.1 Nucleotide sequence alignment ofIS900 gene of different strains

根據(jù)副結(jié)核分枝桿菌IS900基因序列核苷酸同源性比較分析，構(gòu)建遺傳進化樹，如圖4所示。34T-44、34T-45與FJ775181.1(21P,西班牙/2009，綿羊，Ⅰ型)、KJ173784.1(AHRI-4，埃及/2014，奶牛)、AF305073.1(ATCC 53950，新西蘭/2000，牛)、FJ775182.1(CAM 86，西班牙/2009，山羊, III型)、CP022095.1(FDAARGOS_305，美國/1990，奶牛，糞便)、CP022105.1(JII-1961德國/2003，奶牛，II型)、KT075353.1(LAV4，伊朗/2015，人血液)、KY012364.1(MAPIS900VPH12016，印度/2015，水牛，牛奶)在遺傳進化上具有高度的親緣性。

圖5 基于副結(jié)核分枝桿菌IS900基因的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis of IS900 gene of M. avium subsp. paraenberculosis

2.5基于副結(jié)核分枝桿菌亞型的鑒定以副結(jié)核分枝桿菌分型引物DMC529、DMC531、DMC533作PCR檢測，34T-44、34T-45樣品的測序序列與Desmond M. Collins[3]研究結(jié)果中牛型、羊型副結(jié)核分枝桿菌序列核苷酸比較(見圖6)，圖中DMC531/DMC533特異性亞型分型引物擴增的是Ⅱ型(牛型)副結(jié)核分枝桿菌，DMC529/DMC533特異性亞型分型引物擴增的是Ⅰ型(羊型)副結(jié)核分枝桿菌；Sheep株4～21nt核苷酸與Cattle株、34T-44、34T-45樣品相對應(yīng)的核苷酸存在明顯差異，同時sheep株存在一個12 bp串聯(lián)重復(fù)序列和中間4 bp連接序列共同形成的回文序列，這是cattle株所不具有的；34T-44、34T-45與Cattle株序列同源性達到99.0%以上，而與sheep株同源性只有49%，結(jié)果表明34T-44、34T-45樣品為Ⅱ型(牛型)副結(jié)核分枝桿菌。

注：黑色框分別表示DMC531、DMC529、DMC533引物序列及擴增方向。陰影部分代表參考株與待檢序列存在的差異。下劃線代表sheep株12 bp串聯(lián)重復(fù)序列和中間4 bp連接序列共同形成的回文序列。圖6 Ⅰ型(羊型)與Ⅱ型(牛型)副結(jié)核分枝桿菌核苷酸序列比較Fig.6 Sequence alignment of sheep subtype and cattle subtype of M. avium subsp. paraenberculosis

3 討 論

根據(jù)副結(jié)核分枝桿菌插入序列IS900分子的PCR鑒定、亞型鑒定分析，結(jié)合患病馬鹿的臨床癥狀、病理變化、組織抗酸性染色，確定本研究中的馬鹿所感染的是Ⅱ型(牛型)副結(jié)核分枝桿菌。

目前，副結(jié)核病呈世界性流行，養(yǎng)牛發(fā)達國家，如部分歐美國家，澳大利亞、新西蘭等尤為多見。我國在1975年由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)韓有庫等分離出此菌[4]。我國部分地區(qū)牛群副結(jié)核分枝桿菌感染率較高[5]。馬鹿是副結(jié)核病的易感宿主，在國內(nèi)，多位學(xué)者[6-8]開展了馬鹿副結(jié)核病的研究報道，新疆亦有馬鹿副結(jié)核病的報道[9-12]。

馬鹿副結(jié)核病除常規(guī)的臨床診斷外，確診依賴于實驗室診斷方法。馬鹿感染副結(jié)核分枝桿菌到表現(xiàn)出臨床癥狀通常為12個月或更長時間[13]。亞臨床狀態(tài)的馬鹿缺乏典型癥狀，甚至感染的馬鹿臨床表現(xiàn)為健康，因此，僅憑臨床癥狀難以作出準(zhǔn)確的判斷。副結(jié)核分枝桿菌屬于慢生長種，初代分離極為困難[4]，分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為副結(jié)核分枝桿菌種、亞型的準(zhǔn)確、快速鑒定提供了可能。IS900 為副結(jié)核分枝桿菌的一段特異性很高的插入序列[14]，其拷貝數(shù)高達20個，存在于副結(jié)核分枝桿菌，常作為副結(jié)核分枝桿菌PCR檢測基因并用于種的鑒定。但有些分枝桿菌也存在IS900序列[15]，因此，以IS900檢測基因作PCR診斷時，應(yīng)特別注意結(jié)果分析。

從細(xì)菌學(xué)分類上，副結(jié)核分枝桿菌可分為3個亞型：Ⅰ型(羊型)、Ⅱ型(牛型)以及Ⅲ型(生物中間型)，亞型不同其培養(yǎng)特征也各有差異[5]。由于體外培養(yǎng)時間長、培養(yǎng)難度較大，難獲得分離菌，為該菌的亞型分型帶來了一定的難度。根據(jù)Collins 的方法[3]，采用DMC引物作PCR分型可有效地鑒定副結(jié)核分枝桿菌亞型，這方法主要是根據(jù)牛型、羊型基因序列之間存在的差異性，羊型有一個12 bp串聯(lián)重復(fù)序列和中間4 bp連接序列共同形成的回文序列，而這種序列差異性成為副結(jié)核分枝桿菌亞型分型的關(guān)鍵。

副結(jié)核病的潛伏期長，感染后不易被發(fā)覺，同時，患畜長期向體外大量排菌，傳染性強，而易感動物最常見的感染途徑是消化道，通過攝入環(huán)境中糞便污染物而感染副結(jié)核分枝桿菌。嚴(yán)重感染鹿群所繁殖的馬鹿或同群其它馬鹿受到感染而變成永久性的帶菌者，因此，該病很難凈化。馬鹿是副結(jié)核病的易感宿主，34T-44、34T-45馬鹿感染的為Ⅱ型(牛型)副結(jié)核分枝桿菌。據(jù)調(diào)查患病馬鹿所在的鹿場，馬鹿主要是馴化飼養(yǎng)為主，其周邊有牛場、羊場的分布。該鹿場馴化飼養(yǎng)前就已感染攜帶成為隱形或顯性宿主，或者是副結(jié)核分枝桿菌的儲存庫，還是由于外界因素傳入該鹿場，還需做深入地調(diào)查研究。

目前，針對副結(jié)核病尚無有效藥物和疫苗，采取全群檢查、剔除患畜、分群、持續(xù)監(jiān)測以及加強消毒工作等方法是目前防控副結(jié)核病的主要手段，同時，結(jié)合馬鹿副結(jié)核病流行率變化情況，制定有相應(yīng)的防控策略、凈化策略，以降低鹿群中副結(jié)核病的發(fā)展趨勢。因此加強對實驗室診斷研究、流行病學(xué)調(diào)查對其綜合防控具有十分重要的意義。

本研究在傳統(tǒng)診斷方法的基礎(chǔ)上，采用PCR進行快速檢測、亞型分型，提高了鑒定的準(zhǔn)確性，為進一步開展馬鹿副結(jié)核病病原學(xué)研究、流行病學(xué)調(diào)查、防控措施的制定提供了重要的參考依據(jù)。

利益沖突：無