合成生物學新技術在基因表達精確調控和提高脂肪酸合成效率方面的應用

王毓舒， 賀 林， 馬 鋼

(上海交通大學 Bio-X研究院 SJTU-BioX-Shanghai國際基因工程機器大賽團隊，上海 200240)

基因表達調控是一個對生物體內的基因表達進行調節控制的極其復雜的過程，是生物體內細胞分化、形態發生和個體發育的分子基礎，受轉錄水平、翻譯水平和翻譯后水平等不同層次的影響.基因表達調控可以使細胞中的基因表達在時間以及空間上處于有序的狀態，并且對環境條件的變化有所反應.人們通常利用外源分子元件，或者直接利用內源性元件，對基因表達進行不同程度的調控，但外源分子元件在底盤細胞中的運用往往缺乏穩定性，而內源性元件則存在著本底噪聲大、結構未知、調控信號不明等問題.如何減少生物元件間的干擾，簡化分子元件作用模式，充分利用生物底盤來重新編程和合成穩定、高效的人工代謝網絡，是科學家們普遍關心的問題.

合成生物學是生命科學在21世紀剛剛發展出來的一個分支學科，其目的在于利用合成的 DNA 理性地構建新的表達元件、功能模塊、基因線路，甚至是全新的生命體.合成生物學采用“適配”以及系統進化的概念，通過調節不同模塊的表達強度，使功能模塊之間，或者功能模塊與底盤細胞之間進行適配，從而實現代謝流最優化，讓人工生物系統進行高效運轉.基于合成生物學的思維和手段，科學家們構建了用于基因表達調控的元器件，并將其廣泛地應用于疾病診斷與治療、環境監測與控制，以及高附加值化學物品的生物合成中.Shao等[1]基于光遺傳學技術，設計合成一種可由遠紅光亮度來調控胰島素表達的定制化細胞，并將該細胞移植到糖尿病小鼠皮下，當給予糖尿病小鼠遠紅光照射時，就能夠激活體內的定制化細胞表達鼠胰島素或人胰高血糖素樣肽-1的短變體，從而降低血糖濃度，并維持血糖穩定.Dueber等[2]利用多細胞動物的信號傳遞模塊，構建一種蛋白質支架，將多個酶分子進行空間重構，形成一個連續的反應體系.通過配基數量的優化，使幾種酶之間達到一個最優的比例，從而使中間代謝物被快速利用，防止有毒代謝物積累.蛋白質支架的應用不僅降低了高遷移率群蛋白(HMG)對細胞的毒害作用，還將代謝流量提高了77倍[2].沙門氏菌(Salmonella)可分泌抗腫瘤蛋白，幫助機體清除腫瘤，但在正常的組織中表達會帶來副作用.基于沙門氏菌優先在腫瘤組織中累積這一特性，Swofford等[3]在沙門氏菌中安裝了一種群體感應線路，只有在沙門氏菌達到一定密度之后才會開啟抗腫瘤蛋白的表達，實現治療蛋白在腫瘤組織中選擇性表達的目標.精準調控在細胞調節通路和響應復雜環境等方面具有十分重要的作用，利用理性設計的生物元件對生命體的代謝系統進行精密控制具有重大的科學意義和社會價值.

近半個世紀以來，化石燃料使用量的增加導致溫室氣體排放的加劇，對地球生存環境造成不良影響.20世紀70年代提出了生物燃料的概念，以玉米及甘蔗為原料的生物乙醇和以棕櫚油為原料的生物柴油被用來替代化石燃料，但是這類生物燃料的開發也引發了針對因占用糧食和農業用地進行燃料生產所引發的社會和環境爭論[4].許多微生物擁有天然的生化代謝途徑，能夠將生物質轉化為生物燃料的前體.中長碳鏈(C8～C18)的烴醇類物質具有與現有石油基產品更加匹配的結構和化學性能，因此是一種理想的替代性能源[5].烴醇類化合物可以經脂肪酸分子的脫羧和酯化反應獲得[6-8]，而脂肪酸合成途徑是生物生長繁殖所必需的同化代謝途徑，因此，對微生物天然的脂肪酸合成途徑進行改造已成為近年來生物燃料領域研究的熱點[9].值得注意的是，合成生物學技術的日臻成熟能夠幫助代謝工程學家更為科學合理地設計與底盤細胞相適配的功能模塊，平衡生物體內的代謝流，提高人工生物系統的魯棒性[10-11]，極大地拓展了大腸桿菌脂肪酸的合成方式和應用范圍.

基于大腸桿菌細胞中天然存在的生物元器件，上海交通大學iGEM團隊開發了3種基因調控模塊，并將其應用于脂肪酸合成途徑的調控和優化上，實現自由脂肪酸產量的提升，展現人工生物模塊在構建高效率人造細胞工廠方面的潛力和價值.

圖1 兩種調控系統中插入AGG數量與熒光素酶表達量的關系Fig.1 The relationship between inserted AGG number and luciferase expression level in both regulation system

1 稀有密碼子開關——翻譯水平上的精細調控

眾所周知，代謝網絡中的各個組分之間存在一個最適的化學計量比值，當反應體系在這種穩定平衡狀態下工作時，能夠保證各個元件利用的最優化和反應的最大化.傳統的基因工程手段往往是通過啟動子強度的調節和反式元件的應用來調控目標基因的表達強度，當需要在一個互相牽制緊密的代謝途徑中嚴謹地操控各個基因的表達時，傳統方法會明顯暴露出操作的繁冗性和調控精度上的缺陷.由于對應同源tRNA的匱乏[12-13]，稀有密碼子通常會阻礙蛋白表達，所以在代謝工程改造中通常會針對底盤細胞的密碼子偏好對所需調控的基因片段進行密碼子優化，以增強相應蛋白的表達水平[14-15].但是，生物體對密碼子的偏好性恰恰可以被用來開發調控基因表達的分子元件.在大腸桿菌中，AGG、AGA、CUA、AUA、CGA和CCC屬于稀有密碼子，它們在基因中的相對位置決定這個基因的表達水平[16].因此，通過共表達或過表達這些tRNA可以有效地克服由稀有密碼子引起的基因表達障礙[17].利用大腸桿菌的稀有密碼子AGG、AGG對應的同源tRNAArg(CUU)、終止密碼子TAG，可以建立一個作為“稀有密碼子開關”的分子器件，用來精確調控目標基因的表達強度[18].

1.1 受稀有密碼子開關調控的目標基因的表達水平依賴于稀有密碼子的數量

為了實現稀有密碼子開關對目標基因的調控，分別構建含有2、4、6、8個稀有密碼子的熒光素酶表達菌株.AGG序列直接通過PCR加入到luc基因的第2個密碼子之后，緊接在luc基因后的是與AGG對應的同源tRNAArg(CUU)，即argW基因，兩個基因簇同時受異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導型強啟動子T7的調控，其質粒構建見圖1(a).熒光素酶活性檢測結果顯示，Luc蛋白的熒光強度與稀有密碼子數量n的倒數存在線性函數關系，

RLU=a+b/n

(1)

式中：截距a和斜率b是常數.報告基因的表達水平與插入的稀有密碼子數量之間存在一種正相關的線性關系，如圖1(b)和表1所示.為了探究稀有密碼子這一調控元件的穩定性，改變tRNAArg(CUU)的位置，將argW基因置于組成型啟動子trc之下，同時將帶有4、6、8個AGG的luc基因分別連接到組成型的弱啟動子bla之后，報告基因和tRNAArg(CUU)存在于兩個獨立相容的質粒系統中，tRNAArg(CCU)單獨受啟動子trc調控，質粒構建見圖1(c).這樣設計是為了研究目標基因的表達水平是否僅與稀有密碼子的數量有關， 而與啟動子的強度或者與目標基因和 tRNA 的相對位置無關.首先對pET-bla-8AGGluc菌株進行熒光定量，并以此熒光強度為基數推測pET-bla-4AGGluc和pET-bla-6AGGluc的Luc蛋白表達水平.蛋白表達量基于表1中熒光酶的相對亮度和8個AGG之間的比值進行預測.通過熒光素酶活性檢測，發現pET-bla-4AGGluc和pET-bla-6AGGluc的表達水平與模擬值吻合度很高，見圖1(d)和表1，說明不同數量的稀有密碼子對目標基因的調控效果可以通過模型進行擬合推演，這一結果僅與稀有密碼子的數量有關，與對應的tRNA的拷貝數無關.因此，受到稀有密碼子開關調控的目標基因的表達與稀有密碼子數量之間的這種線性關系是非常穩定的，研究人員可以通過公式推導出所需的稀有密碼子數量，將基因表達調控到合適的強度.

表1 由不同的構建類型得到的熒光素酶活性的相對比值Tab.1 The relative ratio of luciferase activities in different construction types

圖2 稀有密碼子元件對E.coli脂肪酸合成效率的優化Fig.2 The optimization of fatty acids sythesis efficiency in E. coli by rare codon element

1.2 用稀有密碼子開關優化大腸桿菌脂肪酸合成途徑

為了挖掘稀有密碼子開關在復雜代謝網絡調控中的潛力，需要選擇一個具有清晰調控模式的代謝途徑作為改造對象.Yu等[19]對在體外對大腸桿菌脂肪酸合成途徑中脂肪酸合成酶系的催化動力學關系進行研究，通過在體外配制不同濃度的酶反應體系，以丙二酸單酰輔酶A(Malonyl-CoA)為底物催化目的產物十六烷酸的合成，最終獲得脂肪酸合成的最優催化體系，并確定當FabG，FabI，FabZ和TesA’這4種酶的物質的量(n)之比為 1∶10∶10∶30時，細胞合成脂肪酸效率最高.基于式(1)，可以推算出當AGG的數量分別為8、4、1時，對應的基因表達量的比值將大約為1∶10∶30.因此，從理論上來說，在對應基因fabG，fabI，fabZ，tesA’的起始密碼子后分別插入8、4、4、1個AGG，可以將這4種酶按照1∶10∶10∶30 (n∶n) 的比例進行調節(該構建名為4Z8G4IT).同時，構建不受AGG調控的ZGIT組和各插入4個AGG的4Z4G4I4T組，將它們作為對照菌株，質粒構建見圖2(a)，其中數字表示緊接在相應基因起始密碼子之后插入的AGG的數量.脂肪酸定量結果顯示，4Z8G4IT組的總脂肪酸濃度為 68.96 mg/L，幾乎是ZGIT組(37.17 mg/L)和4Z4G4I4T組(37.16 mg/L)的2倍，見圖2(b).盡管4Z4G4I4T組中4個酶的表達量受稀有密碼子開關的調控有所下調，但是脂肪酸合成的效率似乎與正常過表達的ZGIT組無明顯差異，而且不論是在總脂肪酸還是C14、C16、C18的組成上均與ZGIT組相近，其中WT為野生型(見圖 2(c)).通過比較這3組菌株的合成能力，再次證明了只有在保證代謝流平衡的條件下對多酶反應進行調控，才能實現酶催化效率的最大化，而稀有密碼子開關這一元件能夠通過簡單地調整基本調控元件的數量來實現對多酶系統中不同基因的精細調控，對于研究體內代謝途徑的酶動力學性質，優化微生物細胞工廠的生物合成效率具有廣泛的應用前景和較大的應用價值.

圖3 基于E. coli跨膜蛋白Lgt的膜蛋白元件設計示意圖Fig.3 The schematic diagram of the design of membrane protein element based on Lgt, an E. coli transmembrane protein

2 細胞膜支架——代謝反應加速器

在代謝網絡改造、組裝及重建上，合成生物支架是一種行之有效的工具.人們在細胞中建立支架，將代謝反應必需的幾種關鍵酶固定在支架上，從而將它們集中在某個特定空間內，減少各個酶之間的距離，可以有效加快酶促反應的速度[2, 20-21].人工支架的運用能夠維持代謝途徑中酶與酶之間能量流的平衡狀態，減少中間產物的累積效應，但由于構建方式的局限性，使細胞內支架的數量受到自身表達或拷貝水平的影響，在調控靈活性和穩定性上無法達到理想狀態[22-23].作為保護細胞的一種天然屏障，細胞膜由磷脂雙分子層構成，這種雙層結構形成了一個相對固定的空間，其中發生相互作用的分子間的空間距離相對較小，且發生在細胞膜附近的反應會由于產物在膜一側的累積效應而加速產物的跨膜運輸，有利于目的產物分泌到細胞外的介質中.同時，細胞膜可以直接感應外部環境以及細胞內部的信號，為人工制造受特定信號調控的分子元件提供良好的平臺.基于微生物細胞膜的這些特點，可以在大腸桿菌細胞內膜這一天然的二維平面上搭建一種蛋白支架，通過將一個代謝反應中的多個酶固定在細胞膜支架上，實現對特定代謝流的加速[24].構建細胞膜支架所需要的基本生物元件包括來源于大腸桿菌的一種內源蛋白前脂蛋白二酯酰轉移酶(Lgt)[25]，一段SRP依賴的蛋白轉運系統的導向序列ssDsbA[26]，以及來源于后生動物細胞的二聚體蛋白系統[27].

2.1 報告基因在細胞內膜上的定位表達

為了驗證錨定元件ssDsbA-LGT的定位功能，分別將編碼β-內酰胺酶的lac基因和報告基因egfp連接在lgt的N-末端和C-末端，質粒構建見圖3(a).在Lgt的兩端分別連接功能蛋白β-內酰胺酶和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，ssDsbA序列負責將融合蛋白導向周質空間.將得到的pETara-Anchor 質粒轉化至BL21細胞中，并且經過L-阿拉伯糖誘導后用激光共聚焦顯微鏡對細胞進行觀察，結果發現pETara-Anchor菌株在細胞邊緣具有明顯的綠色熒光，這說明細胞膜上聚集了大量成功表達的EGFP，從而證明了錨定元件ssDsbA-LGT具備將與之融合的蛋白分子定位在細胞膜上的功能[24].同時，為了探究錨定元件表達的最適誘導濃度，對在不同L-阿拉伯糖和氨芐青霉素濃度條件下的菌株生長情況進行測定，結果發現當L-阿拉伯糖的體積分數為 0.2%時，菌株能夠耐受質量濃度高達200 μg/mL的氨芐青霉素.通過熒光檢測和抗生素耐受實驗，證明ssDsbA-LGT能夠將目標蛋白定位在細胞內膜的兩側空間，并且不會對目標蛋白的生物學功能造成影響.

2.2 報告基因在細胞內膜上的聚合表達

在初步實現將目標蛋白定位在細胞內膜上后，希望通過進一步拉近上膜蛋白之間的空間距離，來改善代謝流.要實現這一目標，需在錨定元件中引入一種二聚體蛋白，這類二聚體蛋白由相互匹配的結合域和配基兩部分組成，選取來自小鼠的SH3、PDZ和來自大鼠的GBD這3種二聚體蛋白.EGFP被拆分成1EGFP和2EGFP兩部分，將它們分別與帶有不同二聚體蛋白結合域或配基的錨定元件的C-末端相連，質粒構建見圖3(b).通過熒光觀察可見：同時表達帶有聚合元件的1EGFP和2EGFP的菌株具有明顯的綠色熒光信號，不帶聚合元件的對照組則沒有信號，由此證明錨定元件與聚合元件的組合能夠將目標蛋白分子在細胞內膜上進行聚攏[24].動物細胞中存在很多具有類似功能的二聚體蛋白，通過構建不同的錨定-聚合元件，能夠方便地利用細胞膜支架將多個酶分子串聯在一起，以提高細胞內的酶促反應效率.

NS—無顯著意義，*—P<0.1, **—P<0.01, ***—P<0.001圖4 不同表達模式的脂肪酸合成酶系對E. coli脂肪酸合成效率的影響Fig.4 The effects of fatty acid synthases with different expression pattern on fatty acid synthesis efficiency in E. coli

2.3 用細胞膜支架加速大腸桿菌脂肪酸合成途徑代謝流

基于DNA、RNA、蛋白質的人工支架通常是通過將生化反應所需要的多個酶分子固定在支架上，來優化特定代謝途徑的反應效率，提高特定產物的生產速率.創造細胞膜支架的目的也在于此.為了驗證其加速代謝流的功能，選擇FabI，FabZ，FabG和TesA’這4種在大腸桿菌脂肪酸合成途徑中起關鍵作用的酶分子作為改造對象，并構建4組具有不同脂肪酸合成酶表達模式的工程化菌株，分別為膜上聚合組(MBF)、膜上自由組(MF)、胞內聚合組(CBF)、胞內自由組(CF).脂肪酸合成系統模式見圖4(a)：MBF組中的4種酶在膜上聚合；MF組在膜上自由表達；CBF組將4種酶在胞質中聚合；胞質表達CF組作為實驗對照組.借助氣相色譜質譜聯用儀(GCMS)對這4組工程化菌株合成的游離脂肪酸的構成進行分析，定量結果顯示：MBF和MF在總脂肪酸產量上沒有明顯差異，但優于CBF和CF，見圖4(b).脂肪酸合成酶系是否在細胞膜上聚合似乎對脂肪酸產量影響不大，出現這一現象的原因可能是與廣闊的胞質空間相比，細胞內膜是一個相對緊湊的空間，被固定在上面的蛋白分子之間的空間距離已經足夠近，以致不需要額外借力就能夠實現酶促反應的加速.同時，當脂肪酸合成酶系在胞質內聚合表達時，工程菌的總脂肪酸濃度要高于自由表達組，這與此前報道的蛋白支架系統對代謝流加速[24]的效果是一致的.

另外，對4組菌的胞外和胞內脂肪酸豐度進行分析，結果顯示：MBF和MF組相比于CBF和CF組而言能產生更多的胞外脂肪酸；不論是聚合組還是自由組，脂肪酸合成酶系的上膜表達均能顯著提升胞外脂肪酸的濃度(MBF/CBF為 5.52 倍，MF/CF為 3.77 倍)，見圖4(c).這是因為帶有細胞膜支架的工程菌所合成的脂肪酸被富集在細胞膜內側，相對于胞外的低濃度環境形成一個較大的濃度梯度，從而迫使脂肪酸被動擴散至胞外，同時也緩解了脂肪酸在胞內累積對脂肪酸合成所造成的反饋抑制，進一步加速脂肪酸合成效率.因此可以認為，細胞膜支架對于細胞內合成終產物的分泌具有一定的促進作用，有助于進一步降低生物燃料的生產成本.

特別值得一提的是，基于同樣的策略，文獻[28]在集胞藻PCC6803中構建了另外一種細胞膜支架，從而將胞外游離脂肪酸的產量提高了近8倍(與野生型集胞藻相比，見圖5)，并且提高了突變藻株對脂肪酸的耐受能力，由此再一次驗證了細胞膜支架在微生物代謝網絡改造和優化中具有良好的應用潛力.

圖5 改造后的集胞藻發酵液表面漂浮著大量脂肪酸油滴Fig.5 Substantial droplets appeared on the surface of engineered Synechocystis broth

3 光控CRISPRi系統——在轉錄水平上對內源基因的精確調控

研究人員對基因表達模式進行重編程的方式已經發展到序列特異性基因靶向技術，包括RNA干擾(RNAi)、鋅指調控子、轉錄激活型效應因子(TALE)和CRISPR介導的調控.在這些技術的實際應用中如果對精確度的要求很高，例如藥物治療，則其調控效能必須在數量上可調.盡管已經有一些分子開關能夠成功地開啟或關閉調控[29-30]，但仍然缺少可以精確定量調節的方法.為此，調控過程必須在一些實時信號的引導下進行.由于光在空間和時間尺度上都具有較高的分辨率，并且能在極短的時間內產生，所以對于分子生物學操作而言，它非常方便，同時對于需要高通量技術的實際應用光是唯一可行的信號.在本文研究中，選取一種合成的藍光感受器YF1-FixJ-PFixK2作為感應外界藍光信號的元件[31].CRISPR干擾(CRISPRi)是一種基因組調控工具[32]，由兩個基本元件組成：一個是突變的 II 型CRISPR/Cas系統中的dCas9蛋白，其缺少內切酶活性；另一個是長度為108 nt的向導RNA序列(gRNA)，其中包含了一個20 nt的堿基配對區來決定其對靶向基因的序列特異性.dCas9∶gRNA復合物結合在目標基因上并阻擋轉錄必需的RNA聚合酶.gRNA介導的干擾在設計上成本較低，而且沒有組織特異性，使用起來非常方便.因此，本文將藍光感受器與CRISRPi相結合，在大腸桿菌中開發了一種可以受藍光控制的基因轉錄調控系統，用來定量地調控外源轉入的載體基因和宿主內源基因的表達[33].

3.1 利用光強對質粒上整合的報告基因進行定量 調控

藍光感受器-CRISPRi系統的構建如圖6所示：藍光感受器由yf1和fixJ構成；啟動子PFixK2控制gRNA的轉錄，gRNA引導dCas9蛋白結合在目標基因的識別位點，阻止轉錄的發生.YF1是一種藍光敏感的組氨酸激酶，在沒有藍光的情況下，YF1磷酸化它的同源響應調控子FixJ，進而激活啟動子PFixK2.將gRNA放置于PFixK2的下游，因此gRNA的轉錄受到藍光的調控.理論上，當藍光變強時，啟動子受到抑制，從而減弱gRNA的表達，CRISPRi對目標基因的抑制效果也將減弱.首先用一種可見的紅色熒光蛋白mrfp作為報告基因檢測該調控系統的功能，并設計一個能特異性靶向結合mrfp的gRNA.在藍光感受器YF1-FixJ-PFixK2的響應范圍內設置以10個光強為一個梯度的從0到飽和的光照強度.為了避免不同實驗組之間由于菌體生長情況不同所造成的差異，在黑暗中將菌株培養至穩定期(OD600=2.2)之后再分成不同的實驗組，在不同光強下繼續培養15 h后，收集細胞對熒光強度進行檢測.結果顯示：mRFP熒光強度的增長和光強呈明顯的正相關關系，隨著光強的增加，mRFP蛋白的表達量也逐漸增加.對不同光強條件下的mRFP熒光強度進行定量測定，由圖7可見：100%光強時的mRFP表達量大約是無光信號時mRFP表達量的2倍；不同光強條件下mRFP表達菌株的表型變化為光強越大，紅色越深.

圖6 藍光感受器-CRISPRi系統構建示意圖Fig.6 The schematic diagram of Blue sensor-CRISPRi system

圖7 mRFP表達量與光強的關系Fig.7 The relationship between mRFP expression and light intensity

3.2 利用光強調控基因組上內源基因的表達

與轉入質粒中進行表達的基因不同，基因組上的內源基因通常是單拷貝的，對它們在轉錄水平上進行調控的方法有所不同.因此，選擇大腸桿菌脂肪酸合成途徑中的一種關鍵蛋白酰基輔酶A合成酶FadD作為研究對象，嘗試用藍光感受器-CRISPRi系統調控fadD基因的表達.利用反向PCR的方法替換gRNA中20 nt的堿基互補區域，使CRISPRi能夠特異性地靶向fadD.同樣，在黑暗中將菌株培養至穩定期(OD600=2.0)，然后分成不同的實驗組.在不同光強下培養15 h后，細胞被收集用來提取RNA.用實時定量PCR來對fadD的mRNA豐度進行測定，以此表征fadD的轉錄水平.大腸桿菌的看家基因gapA作為內參基因，野生型菌株BL21(DE3)被用來進行相對定量，fadD的mRNA含量隨著藍光光強的增加有一個持續而穩定的上升趨勢(見圖8)，回歸分析[33]R2=0.924.結果表明：通過用藍光感受器控制CRISPRi/dCas9系統，能夠將目標基因的表達量與光信號形成一種量化的對應關系.因此，光控CRISPRi系統能夠對內源基因進行精確調控，在代謝途徑優化和藥物治療等領域具有良好的應用潛力.

圖8 fadD轉錄水平和光強的關系Fig.8 The relationship between the transcriptional level of fadD and light intensity

4 結語

本文對3種基因調控元件的構建和應用進行了詳細闡述.這些研究緊扣合成生物學核心思想，獨辟蹊徑地選擇稀有密碼子和細胞膜這兩種生物體內源基礎的分子元件，并將當前廣泛應用的CRISPRi/dCas9基因調控系統與光信號巧妙結合，搭建出一種易于操作的高敏感度的反式調控元件——稀有密碼子開關，一種兼具穩定性和靈活性的內源分子支架——細胞膜支架，以及一種用電腦控制的藍光信號精確調控內源基因表達的調控工具——光控CRISPRi系統.這3種構想的實現為大腸桿菌的基因工程操作和代謝工程研究提供了理論基礎和技術支持，不僅能用于可再生生物燃料前體脂肪酸的制備，而且可以廣泛應用于其他具有高附加值化學物品的生物合成和人工生物系統的構建.