腸上皮下肌成纖維細胞與腸型胃癌相關性的回顧性分析＊

翟真真，王 樂，尚延生，劉 娜，尚淑平，朱黎英，周連泉

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，既往認為胃癌的發生是上皮細胞基因結構及表型的改變所致。 胃癌組織中間質所占比例呈明顯增高趨勢，研究顯示［1］：肌成纖維細胞可分泌多種生長因子，在細胞的增殖、分化、凋亡等方面發揮調節作用，并參與腫瘤的形成。 胃的腸上皮下肌成纖維細胞（intestinal subepithelial myofibroblasts，ISEMFs）作為合胞體存在于上皮下，延伸到整個固有層。 胃的腺體位于ISEMFs 形成的保護性孔鞘中［2］。 腸上皮下肌成纖維細胞（ISEMFs）與胃癌的關系及其在胃癌發生中的作用國內少有報道。 筆者通過對臨床腸型胃癌病例進行回顧性分析， 采用α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體對腸型胃癌患者和非萎縮性胃炎患者胃黏膜病理組織標本進行免疫組織化學染色，觀察腸型胃癌胃黏膜組織中ISEMF 的表達及分布情況，對ISEMF 與胃癌的關系進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取德州市人民醫院病理科2014年10 月—2016 年8 月病理確診為非萎縮性胃炎的胃鏡活檢標本30 例（設為對照組），其中男17 例，女13 例，平均年齡53．32 歲。 病理確診為腸型胃癌標本45 例（設為腸型胃癌組），其中男24 例，女21例，平均年齡56．32 歲。所有病理均經2 位以上高年資病理醫師共同復合診斷。

1.2 免疫組織化學染色 胃癌標本及對照組胃黏膜標本10%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，連續4 μm 切片，用于HE 染色及免疫組織化學染色。兔抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體 （α-SMA），抗體貨號：EPR5368，購于美國abcam 公司；PV6000二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB 試劑盒等， 購自北京中杉金橋生物技術有限公司。 免疫組化染色采用SP 二步法， 石蠟切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，經抗原修復后，滴加一抗（1∶1000），以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。4 ℃孵育過夜。滴加生物素標記的羊抗兔二抗和辣根過氧化氫酶，DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，封片。

1.3 結果判定 利用專業圖像分析軟件對所有攝取的圖像進行分析。 選取200 倍視野觀察整張切片，計數每份標本。 α-SMA 染色后胞質中出現背景清晰的棕色或棕黃色顆粒為陽性細胞，檢測具有代表性的5 個高倍視野內ISEMF 的個數，計算其平均值，用表示。

1.4 統計分析 采用SPSS 22．0（for windows）統計軟件對所得數據進行分析。 資料組間差異比較采用方差分析，所有計量數據以形式表示。 取P＜0．05 為差異具有統計學意義。

2 結 果

非萎縮性胃炎黏膜中ISEMF 的分布與表達：在非萎縮性胃炎黏膜標本中，ISEMF 在正常胃黏膜中表達陽性率低且呈弱陽性，散在分布于腺體間（圖1）； 在腸型胃癌標本中ISEMF 的分布與表達：α-SMA 陽性細胞染色強度增強， 在癌巢間呈現無規律的小片狀分布，不在腺體周圍分布（圖2）；正常對照組每高倍視野ISEMF 為（43．4±6．5）個，腸型胃癌組為（72．3±8．2）個，腸型胃癌組明顯高于對照組（P＜0．05）。ISEMF 分布及表達在非萎縮性胃炎黏膜與腸型胃癌組織中存在明顯差異，在腸型胃癌黏膜間質中有增多的趨勢。

圖1 α-SMA 標記的腸上皮下肌纖維母細胞在正常胃黏膜中的表達（α-SMA，×200）

圖2 α-SMA 陽性細胞在腸型胃癌癌巢間呈無規律的片狀分布（α-SMA，×200）

3 討 論

Cajal 間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）和腸上皮下肌成纖維細胞 （intestinal subepithelial myofibroblasts，ISEMFs）是肌成纖維細胞主要組成成員。 目前研究表明，肌成纖維細胞組成了一個旁分泌家族，在細胞的增殖、凋亡、組織修復及炎癥免疫等方面發揮重要的調節作用［3］。 其中ISEMFs 是位于消化道及消化腺上皮細胞與固有膜之間的肌成纖維細胞， 其存在于食管到肛門的消化道以及膽囊、胰腺的黏膜上皮下［4］，ISEMFs 主要分子標志物是α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）［5］。 目前對ISEMFs研究和報道最多的是在小腸和結腸中［3］，在腸道中ISEMF 分泌ANGPTL2 通過調節骨形態發生蛋白（BMP）和β-連環蛋白（β-catenin ）之間競爭信號的水平來維持腸干細胞龕，對于調節腸道內的干性和上皮傷口愈合具有重要意義［6］，并且其在促進黏膜生長發育、參與大腸腫瘤形成及轉歸等方面作用明顯［7］。

ISEMF 在胃部疾病中相關研究較少，胃的腸上皮下肌成纖維細胞是作為合胞體存在于上皮下，并且延伸到整個固有層，在上皮間質轉化中發揮著非常重要的作用。 胃的腺體位于ISEMFs 形成的保護性孔鞘中［2］。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，盡管數據顯示胃癌的發生率有所下降，但其仍是全球癌癥相關死亡的主要原因之一。 我國是胃癌高發國，根據2018 年發布的《中國腫瘤登記年報，2014》［8］，胃癌發病率居我國惡性腫瘤的第二位，病死率居第三位， 新發病例及死亡病例約占消化道惡性腫瘤的40%。 既往認為其發生是上皮細胞基因結構的改變和表型改變，間質細胞僅發揮被動作用。 但近些年研究發現間質在腫瘤的形成、分化及進展過程中同樣發揮著必不可少的作用。 上皮間質轉化、間質上皮轉化在腫瘤的浸潤、轉移等過程中有著重要的作用。目前研究表明［9，10］，胃的ISEMF 可以分泌肝細胞生長因子、 角細胞生長因子和TGF-β 等多種生長因子，進而調節上皮細胞的分化，ISEMFs 在細胞的分化、增殖和凋亡等方面發揮調節作用，參與腫瘤的形成、組織修復等過程。

該研究應用免疫組化的方法檢測分析腸上皮下肌成纖維細胞（ISEMF） 在胃黏膜中的表達及分布。 結果顯示：在正常胃黏膜組織中，腸上皮下肌成纖維細胞中表達陽性率低且均為弱陽性，散在分布于腺體中間；這與正常大腸黏膜中的分布在上皮基底部不同［11］。 在腸型胃癌中腸上皮下肌成纖維細胞表達陽性率高，在腫瘤組織間呈無規律的小片狀分布。 α-SMA 陽性慢性胃炎對照組每高倍視野ISEMF 為（43．4±6．5）個，在腸型胃癌組每高倍視野ISEMF 為（72．3±8．2）個，兩組具有統計學差異。

該研究結果表明，腸上皮下肌成纖維細胞在胃癌和正常胃黏膜中既存在數量的改變，也存在分布模式和位置的變化。 胃癌α-SMA 表達較正常胃黏膜表達增多，且表達模式改變，無規律地分布于腫瘤病變中，提示腸上皮下肌成纖維細胞的分布與胃癌的發生有一定關系，其相互作用及具體機制有待于進一步研究。