不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠腸道菌群的影響

王藝苑，林姍姍，熱依拉·阿巴拜克熱，陳珊珊，陳潔華，鄧紅

（南方醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，廣東廣州510515）

低聚糖俗稱寡糖，是由2個～10個同種或不同種單糖通過糖苷鍵連接而成的低質量小聚合體。按照生物學功能可分為普通低聚糖和功能性低聚糖，功能性低聚糖因不可被消化大多進入消化道后端被腸道菌群發酵利用，從而誘導雙歧桿菌及乳酸桿菌等有益菌增殖，減少大腸桿菌等有害菌定植，調節腸道pH值的功能[1-3]。

普通人體腸道內蘊藏著龐大的菌群系統，它們的基因總量是我們人體自身基因的100倍以上[4]，并因機體生理狀態、飲食習慣、遺傳、年齡處于動態平衡中[5]，且對機體的營養吸收、免疫調節、防癌抗病等方面起調節作用[6]。膳食改變是影響腸道菌群種類及豐度最重要也較為快速直接的方法。低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）作為一種由葡萄糖和乳糖組成的低聚糖可經發酵誘導有益菌群擴增，常作為益生元添加到嬰幼兒奶粉中以彌補非母乳喂養造成的腸道菌群失衡的負面影響[7-8]，目前低聚果糖（fructo-oligosaccharide，FOS）的研究已有很多，然而低聚半乳糖的攝入推薦量文獻報道沒有統一的結論[9]。

本試驗通過對初斷乳大鼠飲食中添加不同濃度的低聚半乳糖，研究其作為益生元添加到大鼠飼料中對腸道結構、形態功能的影響以及對腸道菌群的調節作用，并與普通飼料組及添加10%低聚果糖試驗組相比較，以期為低聚半乳糖營養補充劑的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼料

30只3周齡雄性初斷乳SD大鼠，體重（40±5）g：南方醫科大學動物實驗中心，動物許可證號為SCXK2016-0041。各試驗組大鼠飼料根據AIN-93G標準飼料配方調整，將纖維素分別并用不同濃度的低聚半乳糖或低聚果糖代替，制作質量濃度0%低聚半乳糖添加飼料（0%GOS），5%低聚半乳糖添加飼料（5%GOS），10%低聚半乳糖添加飼料（10%GOS），10%低聚果糖添加飼料（10%FOS），普通AIN-93G飼料（AIN 93），其中10%低聚果糖為陽性對照，AIN-93G為普通飼料對照。飼料組分：深圳睿迪生物科技有限公司，飼料配方見表1。

表1 飼料組成成分表Table 1 Compositions of the experimental diets g/kg

1.2 試劑與儀器

低聚半乳糖GOS（82.8%）：英國BimunoTM公司；低聚果糖 FOS（92.7%，Synergy1）：比利時 Beneo公司；4%多聚甲醛溶液：廣州Panera生物有限公司；HE染色液（蘇木素/伊紅）試劑盒：湖北白奧斯生物科技有限公司；其余試劑為分析純。

YP10001電子天平：常州衡正電子儀器有限公司；IX73倒置顯微鏡：日本 OLYMPUS公司；Modell RM2135石蠟切片機：德國Leica公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 分組及干預

30只初斷乳大鼠適應性喂養3 d后，按照體重隨機分為0%低聚半乳糖組、5%低聚半乳糖組、10%低聚半乳糖組、10%低聚果糖組、普通飼料飼喂組，并投喂相應種類的飼料。大鼠單籠飼養在清潔動物房不銹鋼籠中，采用塑料飲水瓶自由給水，溫度控制在22℃～25℃，濕度控制在45%～60%，每日給予光照12 h，室內循環換氣。每天下午4：00定時收集大鼠糞便，稱重記錄后于-80℃冰箱中保存。記錄大鼠起始體重及每日進食量，每2 d對大鼠體重進行稱重記錄，計算體重增加量。

1.3.2 組織樣本制備

連續干預14 d，每組大鼠禁食12 h后，用10%水合氯醛麻醉后，分別取空腸、盲腸，于4℃生理鹽水中漂洗干凈腸道內容物后，取中間1 cm小段于4%多聚甲醛中常溫下充分固定，剩余部分放入凍存管中，迅速放入液氮，之后-80℃保存。取盲腸稱重，用無菌手術刀剖開后，一次性藥勺刮取盲腸內容物分存于凍存管中，-80℃保存。

1.3.3 組織學檢查

經4%多聚甲醛充分固定的組織塊在梯度酒精中進行脫水處理，然后將脫水的組織透明處理，依次經過浸蠟、包埋、修快、切片和粘片步驟，而后用二甲苯對切片進行脫蠟、復水、及蘇木精-伊紅乙醇染色，染好色的切片用中性樹膠封片，觀察。用數碼醫學圖像采集處理系統采圖，測量回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度等形態學指標。

1.3.4 腸道菌群檢測

采用糞便DNA提取試劑盒提取腸道菌群細菌基因組DNA后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，質控合格后，使用無菌水稀釋樣本至1ng/μL。對細菌基因組進行16S rDNA PCR擴增，采用正向引物341F和反向引物806R進行V3+V4區擴增。正向引物序列為 341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’，反向引物序列為 806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。送至北京諾禾生物股份有限公司，PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，后根據PCR產物濃度進行等質量混樣，使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的Life Ion S5TM或Ion S5TMXL進行上機測序。使用Cutadapt軟件過濾和按barcode拆分樣本后，對所有樣本的Clean reads以97%的一致性進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析。

1.4 統計學方法

用SPSS20.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 低聚糖類益生元對初斷乳大鼠體重及糞便的影響

體重增長趨勢見圖1。

試驗前各組大鼠體重基本相同，14d干預后大鼠體重出現不同程度的增長，其中10%GOS組增長量最少，普通組增長量最大，10%FOS組與普通組接近，但差異均不存在統計學差異（p＞0.05）。根據圖1，各組增長趨勢相近。

圖1 體重增長趨勢圖Fig.1 Body weight growth trend

不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠糞便質量的影響見圖2。

圖2 不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠糞便質量的影響Fig.2 Effect of different concentration of galacto-oligosaccharide on the weight of fecal feces

肉眼觀察，各試驗組大鼠糞便形態顏色等有明顯差異，0%GOS組糞便色黑質硬，形狀短圓，普通組糞便色灰白質稀疏，形狀多呈規則橢圓，添加益生元類組糞便呈現棕黃色，質濕軟形態呈長條狀。糞便總質量有統計學差異（p＜0.01），0%GOS組與其余各組均存在統計學差異，5%GOS組與10%GOS組無差異，10%FOS與普通組間無差異，其余各組間均存在統計學差異。

不同濃度的低聚半乳糖作為益生元添加到大鼠每日飼料中未影響到大鼠的進食量及體重增長情況，干預期內大鼠毛發光澤，喜活動，精神狀態良好。目前研究普遍認為低聚糖類益生元具有增加糞便含水量及體積從而軟化糞便，改善便秘的作用[10-11]，元添加組的糞便量較空白組有所增加，其中10%GOS組比5%GOS組的促排便能力要強，推測低聚半乳糖對便秘調節功能主要是依靠食物的物理吸水性來增加糞便體積及腸道的潤滑程度，并與菌群改變與發酵產物有一定關系。

2.2 低聚糖類益生元對初斷乳大鼠肝臟及盲腸質量的影響

不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠肝臟及盲腸質量的影響見表2。

表2 不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠肝臟及盲腸質量的影響（±s）Table 2 Effects of different concentrations of galactooligosaccharide on the weight of liver and cecum in the newly weaned rats（±s）

表2 不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠肝臟及盲腸質量的影響（±s）Table 2 Effects of different concentrations of galactooligosaccharide on the weight of liver and cecum in the newly weaned rats（±s）

注：肝臟指數=肝臟質量/體重，盲腸指數=盲腸質量/體重。標號表示相比較時存在統計學差異：a與0%GOS組相比；b與10%FOS組相比；c與 AIN 93 組相比，p＜0.01。

組別 肝臟質量/g 肝臟指數/% 盲腸質量/g 盲腸指數/%0%GOS 10.42±1.10 7.02±0.69 1.73±0.48a 1.19±0.39a 5%GOS 8.42±3.04 5.82±1.73 3.97±1.11ab 2.76±0.51ab 10%GOS 8.68±0.91 6.43±0.64 6.85±1.51c 5.08±1.10c 10%FOS 9.74±1.15 6.51±0.54 6.06±1.78c 4.05±1.11c AIN 93 9.32±1.83 6.37±1.49 1.67±0.21a 1.11±0.17a

各試驗組肝臟質量及肝臟指數有不同，但不存在統計學差異（p＞0.05）。盲腸質量有顯著差異（p＜0.01），其中0%GOS組與普通組間無統計學差異外，與其他各組均有統計學差異（p＜0.05），10%GOS組盲腸質量最大（見表2）。

病理檢查研究發現，各組大鼠臟器變化不大，但空腸、盲腸形態結構發生變化，尤其盲腸差異巨大，補充低聚糖類益生元組的盲腸體積、質量、盲腸內容物質量均發生顯著變化，其中10%GOS體積和質量最大，分析原因，可能與低聚糖類益生元在腸道內雖不能被消化吸收卻可以經發酵后產酸產氣，改變腸道酸堿環境有關[12]。本研究發現與杭蘇琴早先發表果寡糖對于仔豬腸道形態變化研究結果類似，FOS組仔豬小腸絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度之比均高于對照組，且胃腸道內有機酸增高顯著[13]。

2.3 低聚糖類益生元對初斷乳大鼠腸道形態結構的影響

不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠腸道絨毛高度及隱窩深度的影響見表3。

各組大鼠空腸的絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度比值無明顯變化，其中，表3可見，0%GOS組低于其他試驗組及普通飼料組，但差異無統計學意義。盲腸絨毛高度有明顯變化，其中0%GOS組最短，10%GOS組最長，低聚糖添加組較普通組有所增長。盲腸絨毛高度/隱窩深度的比值亦存在0%GOS組最低，且結果又統計學差異（p＜0.05）。

表3 不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠腸道絨毛高度及隱窩深度的影響（±s）Table 3 Effects of different concentration of galacto-oligosaccharide on intestinal villi height and crypt depth in newly weaned rats（±s）μm

表3 不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠腸道絨毛高度及隱窩深度的影響（±s）Table 3 Effects of different concentration of galacto-oligosaccharide on intestinal villi height and crypt depth in newly weaned rats（±s）μm

注：標號表示相比較時存在統計學差異：a與0%GOS組相比；b與AIN 93組相比，p＜0.01，x與0%GOS組相比，p＜0.05。

項目 0%GOS 5%GOS 10%GOS 10%FOS AIN 93空腸絨毛高度 240.58±30.64 258.25±20.97 249.92±35.61 258.39±31.60 258.82±40.03空腸隱窩深度 150.43±18.84 153.17±17.09 152.23±26.18 152.83±13.03 153.02±19.98空腸絨毛高度/隱窩深度 1.61±0.15 1.70±0.20 1.64±0.25 1.68±0.16 1.69±0.21盲腸絨毛高度 139.31±14.62 205.31±20.44a 216.13±27.63a 209.96±20.13a 194.91±23.59a盲腸隱窩深度 33.35±7.72 25.40±11.72 23.49±9.85 27.03±9.59 21.08±6.13盲腸絨毛高度/隱窩深度 4.41±4.46 9.77±4.50 10.71±4.84x 8.81±3.80 10.19±4.04x盲腸肌層厚度 226.99±56.11 167.72±50.85ab 163.35±49.63ab 165.50±20.34ab 268.43±50.13

不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠盲腸結構形態的影響見圖3。

顯微鏡下觀察腸道切片形態，空腸處各組干預組變化不大，但盲腸的絨毛高度有顯著差異（見圖3），較0%GOS組，各組均明顯升高（p＜0.01）。絨毛高度的升高及絨毛高度/隱窩深度的比值增大表明腸道具有更強的吸收能力，因此盲腸器質類改變表明功能狀態的改變，低聚半乳糖的增加干預誘導刺激了絨毛的增長，使腸道吸收能力更優，其可能與某些文獻中報道的低聚糖類益生元類物質增加鈣、鐵、鎂等礦物質有關[11，14-15]。

2.4 低聚糖類益生元對初斷乳大鼠腸道菌群的影響

不同低聚半乳糖組腸道菌群排名前10的菌種相對豐富度見圖4A。

不同低聚半乳糖組腸道菌群雙歧桿菌與乳酸桿菌相對豐富度見圖4B。

聚類分析后選取試驗組在屬分類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形圖（圖4A），可直觀查看到低聚糖添加飼料中雙歧桿菌及乳酸桿菌的組分明顯增加，其中10%GOS組增加最明顯，甚至優于10%FOS陽性對照組（圖4B）。

圖3 不同濃度低聚半乳糖對初斷乳大鼠盲腸結構形態的影響（HE染色，100倍放大）Fig.3 Effects of different concentrations of galacto-oligosaccharide on the structure and morphology of cecum in newly weaned rats（HE，100X）

圖4 不同低聚半乳糖組腸道菌群物種相對豐富度柱形圖Fig.4 Histogram of relative abundance of intestinal microbiome in different galacto-oligosaccharide groups

圖5 不同低聚半乳糖組腸道菌群PCoA圖Fig.5 Principal co-ordinates analysis of intestinal microbiome distribution in different galacto-oligosaccharide groups

不同低聚半乳糖組腸道菌群分布主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）見圖5。

基于Weighted Unifrac距離來進行主距離分析PCoA，如果樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似，因此群落結構相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠遠分開。由圖5可見，各組不同干預組大鼠的腸道菌群的群落分布差異明顯，低聚糖添加組多聚集在一起，即菌群結構相似。

不同低聚半乳糖濃度組雙歧桿菌豐度MetaStat分布見圖6。

進一步篩選組間具有顯著性差異的物種并繪制差異物種在組間的豐度分布箱圖（圖6）。下圖顯示在雙歧桿菌種屬下各組的差異，0%GOS組與其余濃度低聚糖添加組均有差異，且（p＜0.01），普通組與低聚糖組也存在統計學差異（p＜0.01），其中10%GOS對于雙歧桿菌的增長作用最顯著。

目前，越來越多的研究表明腸道菌群的穩態與人體健康息息相關，它與心腦血管疾病、代謝性疾病，胃腸道炎癥及自身免疫綜合征等疾病的關系也在層層揭開[16-17]。本研究通過細菌16S rDNA保守區擴增后，對高變區V3V4區進行測序及菌種測定后發現，低聚半乳糖添加組中雙歧桿菌與乳酸桿菌的增殖較空白對照及普通對照發生明顯升高，其中10%GOS組對于促進益生菌增殖作用最顯著，致使大鼠腸道菌群組成出現差異。即從物種豐度前十的相對豐富度上看，低聚半乳糖添加組的雙歧桿菌與乳酸桿菌顯著增多。雙歧桿菌與乳酸桿菌作為人體內組成優勢菌的有益菌群，其豐度和分布占據著重要作用，一旦兩者數量增多可抑制大腸桿菌、產氣莢膜菌等條件致病菌的增殖[18]。低聚果糖的雙歧因子作用在改善腸道菌群方面已獲得較多較全面研究[19-20]，從PCoA圖可以看到添加了低聚糖類益生元的組別相距較近說明物種差異不大，但是進一步關注組間差異性物種，5%、10%低聚半乳糖組改善腸道菌群的能力相較于10%低聚果糖的陽性對照組也存在一定優勢，發現低聚半乳糖對于雙歧桿菌的增殖效果更顯著。

圖6 不同低聚半乳糖濃度組雙歧桿菌豐度MetaStat分布Fig.6 MetaStat distribution of bifidobacteria in different galactooligosaccharide concentration groups

3 結論

低聚半乳糖的添加可在一定程度上改善大鼠的腸道吸收能力，并有效促進腸道中雙歧桿菌與乳酸桿菌的增殖，并且高濃度低聚半乳糖的添加可以更顯著的改善腸道菌群。5%、10%低聚半乳糖組改善腸道菌群的能力相較于10%FOS存在一定優勢。