microRNA在植物生長發育中的研究進展

黃俊駿 劉文文 郭亞如 蔣天慧 任晴 王華華 梁衛紅

（河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007）

miRNA是一類內源性的非編碼小RNA，通過miRNA基因的轉錄，DICER蛋白將初級miRNA轉錄本加工成成熟的miRNA，并加載成熟的miRNA進入ARGONAUTE蛋白，組裝成沉默復合體（miRISC，miRNA-Induced Silencing Complex），靶向序列互補的基礎上，miRISC負調控基因表達，從而調控植物的生長發育［1-2］。

近年的研究表明，植物諸多生物學過程都受到miRNA的調控，包括細胞維持和分化、生長發育、信號轉導及對環境因素脅迫的響應。植物由于受到其固著生長方式的限制，常常會受到包括極端溫度、干旱、鹽、重金屬等不利環境因素的影響，植物miRNA表達量會隨環境因素變化而改變，miRNA通過調控其相應靶基因的表達，使植物在生理及形態上產生對環境的適應性，如響應熱激的miR160［3］、與低溫脅迫和金屬離子脅迫相關的miR393［4-5］、與干旱脅迫有關的 miR165/166［6］、與養分吸收有關的miR408［7］、與鹽脅迫相關的 miR398［8］，以及與免疫相關的miR6019/6020［9］等。作為重要的調節分子，miRNA同樣也參與了生命過程中一系列的重要進程，而且在植物生長發育過程中扮演了重要角色。miR165/166已被證明參與了植物莖端分生組織、根部頂端分生組織的維持、調控花藥和胚珠形態建成等多個方面［10-14］；miR164在腋生分生組織的發育、植物葉片的衰老以及控制花瓣的數量等方面起重要作用［15-18］；miR172在土豆塊莖形成、豆科結瘤和花器官發育等過程中發揮著重要調控作用［19-25］?？梢哉f，植物miRNA幾乎參與調控植物所有重要的發育過程，包括葉的發育、器官極性、花的形態建成、開花時間等。同時，越來越多的證據表明，miRNA在植物的生長發育過程中起著重要的調控作用。本文主要介紹植物miRNA在植物生長發育方面的最新研究進展以及理解miRNA在植物發育可塑性中的作用，并對今后植物miRNA的研究做出了展望。

1 miRNA在植物生長發育中的功能

1.1 miRNA在分生組織中的作用

分生組織是產生和分化其他各種組織的基礎。植物的發育依賴于莖端分生組織（Shoot apical meristem，SAM）的活性，而SAM則是尖端包含一群干細胞的特殊區域。在每個分生組織中，干細胞自我更新和器官/分生組織分化之間的動態平衡對于植株的正常發育十分重要。STM（Shoot meristemless）-WUS（Wuschel）-CLV（Clavata） 通路是SAM中維持干細胞的基礎機制［26-27］。在一定程度上，花分生組織中亦是如此。miRNA通過靶向調節STM-WUS-CLV信號通路中的多個蛋白，有利于SAM的發育及維持。

miR394在SAM表面的單細胞層-L1層中產生，通過向下擴散到組織中心（Organising centre，OC）。在 OC中抑制LCR（Leaf Curling Responsiveness）的表達［28］，該蛋白能直接抑制SAM特異基因WUS的表達［29］。雖然L1層miR394的濃度高于OC層，但是miR394對LCR的抑制作用僅發生在OC中［28］，表明miR394的精確濃度對其功能至關重。同時，miR394-LCR介導的干細胞調控過程中具有多樣化的功能［30］。

miR165和miR166是SAM維持中涉及的另一類重要的miRNA，亦是兩個相差一個核苷酸的相關的miRNAs，通過AGO1和AGO10來調控HD-ZIP III（Class III Homeodomain-Leucine Zipper）轉錄物，調控分生組織發育及器官極性。由于miR165/166基因座和靶基因的多樣性導致了它們在植物發育中復雜的調控作用。AGO1在整個頂點表達，招募miR165/166靶向切割HD-ZIP III mRNA，阻止HDZIP III的積累，從而阻止異位分生組織的發生［10］。AGO10特異性地隔離miR165/166對抗AGO1-miR165/166的沉默活性，從而實現局部富集HD-ZIP III轉錄物，HD-ZIP III轉錄因子REV（Revo-Luta）作為分生組織維持的正反饋機制促進AGO10的表達，從而促進 SAM 的發育［10-11］。AMP1（Altered Meristem Program 1）作為負反饋調控因子，通過限制HD-ZIP III介導RAP2.6L（At5g13330）的表達來限制SAM的增殖和再生［12］。

miR164通過靶向Cup-Shaped Cotyledon基因（CUC1，CUC2和CUC3）來調控植物腋生分生組織的發育。通過上調miR164的表達或突變miR164，分別導致靶向CUC下調以及腋生分生組織的消失和CUC轉錄物的增加以及葉緣產生異位的腋芽樣結構［15］。作為雙子葉植物啟動結合蛋白（Squamosa promoter binding protein-like，SPL）家族的同源物TSH4（Tassel Sheath 4），在單子葉植物中，腋生分生組織的發育由其控制，它的活性通過miR156來調控進而促進分蘗，如玉米穗發育過程中通過TSH4-miR156途徑調節谷粒的結構［31］，柳枝稷通過SPL-miR156途徑來調節分蘗［32］，相反的，擬南芥通過SPL-miR156影響葉間期而不是分生組織的起始［33］。目前已經通過對大豆miR156b的操作，利用miR156-SPL-WUS途徑改善了大豆植株的枝條結構和產量［34］。這些結果表明，miR156在不同的植物中，它的功能會隨著不同的組織而發生改變。

1.2 miRNA調控植物幼年期向成年期的轉換

植物營養生長幼年向成年轉變是植物發育的重要過程之一，是植物開花生殖生長的基礎。研究表明，植物幼年期向成年期階段轉變（即營養生長階段轉變）受保守的miR156-SPLs途徑所調控。miR156是進化過程中最保守的miRNA。

在幼苗階段，miR156的表達非常高，而miR172表達非常低。然而，隨著植物生長，miR156表達逐漸下降，靶基因SPL的表達逐漸上調，SPL家族基因編碼的轉錄因子SPL9/SPL10 可以直接結合在miR172的啟動子上激活其表達，當這些變化達到閾值時，植物形態發生顯著變化，促進植物由幼年生長到成年生長的轉換［35］。在毛竹芽發育的早期階段，葡萄糖通過調節miR156靶向的PeSPL9表達水平來介導形成成體葉［36］。由此可見，miR156-SPL/miR172-AP2（Apetala 2）介導的從幼年到成年的轉換機制可能在高等植物中廣泛存在。因此，miR156和miR172 皆可視為植物年齡的分子標記。在基因工程中，可通過靶向單個miRNA調節植物的相變，從而控制生命周期并進一步調節植物生物量和種子產量［37］。

1.3 miRNA在葉形態建成中的作用

高等植物的葉片呈現明顯的近-遠軸極性。葉由莖尖生長錐側面的葉原基發育形成，葉原基形成于SAM的周邊區（Peripheral zone，PZ），在初始葉原基中近-遠軸極性已經建立。在葉片近-遠軸極性的建立過程中，包括轉錄因子、小分子RNA、細胞分裂的因子等許多關鍵的調節因子參與其中。與在SAM中一樣，AGO1對于將miR165 / 166靶向葉中的HD-ZIP III轉錄物是必需的，是miR165 / 166調節和限制PHB（Phabulosa/AtHB14）到近軸側所需的［13］。類似AGO1，AGO10在葉片近軸側的定位是抑制非細胞自主miR165 / 166活性和維持HDZIP III mRNA在該區域中的積累所必需［14］。在上述過程中，需要miR390及其效應因子AGO7的參與tasiRNA（Trans-acting short-interfering RNAs）中的一個亞類TAS3 tasiRNA通過調節遠軸面促進因子ETT（Ettin）/ARF3（Auxin response factor 3）及ARF4的表達貢獻于近-遠軸極性的建立［38］。該信號途徑在陸地植物中是保守的。

miRNA也參與調節葉片形狀。作為器官原基邊界形成所必須的基因CUC2受TCP（Transcription factor TCP）的雙重調控。研究表明，TCP4蛋白能直接與CUC2結合，抑制自身的二聚化和CUC2的轉錄活性。TCP4-CUC2能被SPL蛋白破壞從而恢復CUC2功能［39］。當植物老化后，SPL水平增加而導致CUC2活性增加以及葉片復雜性增加。TCP4又由另一種miR319控制［40］。在擬南芥中編碼miR319的JAW（Jagged and Wavy）基因一旦發生突變，植株表現出葉片形狀和曲率方面都極不均勻，該過程是miR319可以通過降解TCP類轉錄因子家族的mRNA來調控擬南芥葉子的生長發育［41］。除了對CUC2的直接影響外，CUC2表達亦可由TCP基因調節CUC2阻遏物miR164的活性來進行間接調節［16］。CUC2-miR164系統在復合葉片進化中起關鍵作用［17］。同時miR319-TCP4通過調控茉莉酸（Jasmonate acid，JA）生物合成通路來控制葉片的衰老［42］。

葉片的大小主要受生長調節因子（Growthregulating factor，GRF）調節，GRF亦是參與控制細胞分裂和延伸的轉錄因子。在擬南芥中GRF基因突變導致葉片變小，當GRF基因過表達則產生顯著更大的葉片［43］。值得注意的是，TCP能夠調節miR396［44］，而miR396靶向GRF基因。在擬南芥葉片中，在葉片遠端表達的miR396限制了GRF活性，從而將細胞增殖限制在葉片近端。隨著葉片的成熟，miR396在發育的葉片中增加，導致GRF降低，進而阻止葉片的生長［45］。研究表明，miR396對GRF的調控在苜蓿和水稻中是保守的，但體現在結瘤和花發育兩個完全不同的發育過程中［46-47］。miR396-GRF途徑以相同的方式調節葉片不同方向的生長，通常miR396在葉片成熟的區域中表達，并且在正在進行的細胞增殖區域中不存在［48］。由此可見，TCP在葉子的極性、形狀和老化過程中起主要集線器的作用，TCP-miRNA這個錯綜復雜的網絡是進化過程中是如何形成的，有待進一步的研究。

1.4 miRNA在花器官發育中的作用

開花是植物從營養生長轉換為生殖生長以產生花并最終產生種子的生理發育過程，受多個因素誘導，在植物生長和物種進化中處于核心地位。miRNA是開花調控中的一個重要因素，特別是miR172。miR172靶基因是AP2類轉錄因子家族，包括AP2、TOE1和TOE3（Target of Eat 3）等，它們在被子植物、裸子植物及蕨類植物均有發現，都是FT（Flowering Locust）基因的轉錄抑制子。AP2是ABC模型中的A類同源異型基因，在花發育早期，miR172在SAM中積累，抑制AP2，阻止植物花分生組織的形成。同時，AP2基因的mRNA 在花發育的所有4 輪器官原基中都有積累，在花器官的發育過程中調控著其他基因［49］。例如，在花原基的中心，miR172和C同源異型基因AG（Agamous）都有較強的表達，miR172抑制了靶基因AP2的表達，避免了A和C同源異型基因的共表達，從而確定了花瓣和雄蕊之間的邊界［22］。此時，AP2也負調控miR172，形成一個反饋回路，這對于花器官的正常發育至關重要［23］。研究發現，TOE3作為miR156和miR172信號網絡中的一部分，過表達miR172靶向的TOE3轉錄物會導致花器官大小增加并保持花分生組織特性。同時SPL3能激活TOE3和miR172，這3種成分的相互作用形成一個精巧的調控環，精細調整TOE3 的定位［24］。

在玉米中，miR172靶向AP2同源物IDS1（Indeterminate spikelet 1），其突變體具有缺陷的心皮和雄蕊［25］。在大麥中，miR172靶向AP2同源物CLY1（Cleistogamy 1），其突變體表現出在自花受精前閉花［50］，在此途徑中同時調節JA和 赤霉素（Gibberellic acid，GA）來促進開花期間的莖生長［51］。在大豆中，miR172 靶向GmTOE4a，調控開花整合因子GmFT2a 和Gm-FT5a，以及花分生組織決定基因GmAP1和GmLFY（GmLEAFY）來實現調控開花［52］。在金絲桃和矮牽牛中，miR169控制這些物種中AG同源物的表達，其突變體表型和過表達C基因或失去A基因的表型一致［53］，這意味著miR169對增強C基因轉錄至關重要?？傮w而言，在花器官形成期間，miR172和miR169控制ABC基因的表達模式，增加了ABC模型的復雜性。

一旦花器官形成，就會生長并發育成復雜的結構，并且已經證明幾種miRNA參與了這一過程。miR164 靶向NAC（NAM，ATAF1 / 2和CUC2）類轉錄因子家族，其突變體表現出花瓣的數量較野生型明顯增多，暗示miR164通過調節轉錄因子CUC1和CUC2等的表達水平來控制花瓣的數量［18］。在葉片中，miR319-TCP途徑調節花瓣形狀和大小，miR319a的突變導致花瓣長度和寬度都減少了［54］。在 擬 南 芥 中，miR396-GRF-GIF（GRF-interacting factor）途徑影響花粉母細胞的起始［55］。在番茄中，miR171靶向GRAS（GAI，RGA和SCR）轉錄因子SlGRAS24，其過表達會產生具有小花粉囊和開裂的雄蕊［56］。在青菜中，過表達miR158的轉基因株系會導致花粉敗育以及花粉活力降低［57］。miR393靶向運輸抑制因子反應1（TIR1）和AFB（Auxin Signaling F-BOX）基因，這些基因也參與花的發育［58］。

近些年來，越來越多的miRNA被證實通過抑制或促進營養生長到生殖生長的相變來調控植物的開花時間。通常在植物幼年期，miR156被AGL15（Agamous-like 15）和AGL18激活，進而抑制轉錄因子SPL的活性，促進AP2-LIKE蛋白質的產生以抑制開花［59］。在植物到達成年并準備開花時，miR156水平降低導致SPL蛋白的產生，SPL通過直接激活FRUITFULL、LEAFY等關鍵開花基因，同時也激活和促進miR172的轉錄，miR172靶向降解AP2類轉錄物，觸發相變，使植物進入開花期［35，60-61］。在水稻中，miR156直接靶向 LAX1（Lax panicle 1）的表達來調控穗的發育［62］。這也是為什么在許多物種中，miR156的過表達延遲了開花，而miR172的過表達促進了開花的原因［25，63］。同時也表明miR156決定植物的幼年期，而miR172決定植物的成年、生殖和開花期。在水稻中，SPL9- miR528-RFI2（Red and Far-red Insensitive 2）途徑來調控開花時間［64］。因此，miRNA對植物花器官的正常發育和繁衍是至關重要的。進一步研究miRNA如何介導花發育以及開花時間的分子調控網絡有利于我們深入了解花發育背后的一系列重要科學問題，同時對作物的重要經濟形狀改良起借鑒作用。

2 miRNA在植物發育可塑性中的功能

植物可塑性發育是指同一基因型的植物在不同的環境條件下表現型會發生巨大的變化，是植物更適應環境變化的一個重要策略。miRNA不僅是植物發育的主要調節因子，而且還參與了由各種環境刺激引起的植物發育表型可塑性的調節［65］。適當的低溫可以促進植物成花。miR156和miR172都被認為是植物年齡的分子標記，而在擬南芥中，兩者均被發現亦可參與調控植物對溫度變化的響應并微調開花時間［66］。當周圍環境溫度降低時，miR156被上調，一方面抑制SPL3，導致FT和FRUITFULL的下調以及開花延遲［66-67］；另一方面，miR172被下調，進而激活AP2來抑制FT，結果也是開花延遲［66］。這意味著miRNA通過兩條不同的途徑來實現對開花時間的控制。miR156也在植物避蔭綜合征調控過程中起重要作用。擬南芥在遮蔭條件下光敏色素的功能受到抑制，導致光敏色素相互作用因子（Phytochrome-interacting factors，PIFs）蛋白快速積累，PIF蛋白能抑制miR156的表達，進而引起其靶基因SPL家族成員表達升高，后者進一步調控了植物株高、分枝數目、葉柄長度、葉片數目、葉片面積及開花時間等一系列重要農藝性狀的改變，揭示了光敏色素PIF和miR156-SPL在植物避蔭綜合征調控過程中存在著功能關系［68］。

在高硝酸鹽條件下，一方面，保守的miR167水平下降，其靶向蛋白AUXIN反應因子8（ARF8）在周環和側根冠中積累，從而增強生長素信號傳導以促進側根的形成和抑制主根的伸長［69］；另一方面，生長素受體AFB3（Auxin Signaling F-BOX 3）基因被誘導，但在硝酸鹽還原和同化過程中形成的一些代謝物可誘導miR393表達以抑制AFB3表達，即AFB3介導的響應于硝酸鹽變化的生長素信號傳導是短暫的［70-71］。在氮素誘導下，OsmiR393積累，降低靶標基因OsTIR1（Transport Inhibitor Response 1）和OsAFB2的表達，減輕葉腋中生長素的敏感性并使OsIAA6（Auxin-responsive Aux/IAA）穩定，進而促進水稻分蘗［72］。在有毒鋁脅迫下，miR393被下調，其靶向生長素受體基因HvTIR1和HvAFB表達增強，增強了生長素信號傳導，加劇了鋁脅迫引起的根伸長受阻［7］。鋁脅迫能夠誘導細胞分裂素合成的關鍵基因IPTs（Adenosine phosphate isopentenyltransferases）在根尖轉化區上調表達并最終導致該部位細胞分裂素水平的大量積累及根伸長的抑制［73］，在這個過程中，具體是哪個miRNA起作用還有待進一步的研究。植物在受到UV-B輻射后，miR396被誘導并抑制其靶GRF，進而介導葉子生長的抑制，這是植物阻止細胞周期的適應性策略，允許時間修復UV-B誘導的DNA損傷［74-75］。

綜上所述，植物在調整其對營養素的反應、環境刺激時，皆由miRNA介導，通過靶向發育中各種關鍵基因或與植物激素信號傳導的整合，如細胞分裂素還能夠以協同的方式參與生長素介導的鋁抑制的根伸長，即植物微調自身發育反應的策略來促進植物適應動態變化的環境。

3 展望

在植物發育過程中，miRNA在調控分生組織特性，葉極性、形態和大小，以及花器官發育過程中起著重要作用，甚至在各種環境刺激下，miRNA充當環境響應調節因子，賦予植物表型并促進植物的進化和適應。值得一提的是，不同的植物采用通用的策略來調控各種發育，如擬南芥與大巖桐的miR172［76］；同一miRNA可在不同組織中發揮不同的功能，如AGO10［10-11，14］；利用相同的途徑以實現不同的發育過程，如 miR156/miR172［32，36，68］。有研究表明，在擬南芥整個生活史中，相比發育階段，組織器官對miRNA的表達影響更大［77］。那么在植物生長的過程中是否可以改進對植物器官的處理技術來調控miRNA的表達，進而改善植株的生長狀態，這對于某些經濟作物與觀賞植物來說具有非常重要的意義。

植物miRNA出現在幾乎所有已檢測的生物發育過程中，也使我們對miRNA重要性的認識不斷提高，但是目前確認的miRNA數量和功能與所在總基因中所占比重的數量相比相差甚遠，而且，我們的研究還僅僅局限于證實miRNA和靶基因參與了植物生長發育的調控，但對miRNA如何在發育及組織細胞水平特異地調控某個生物學過程，以及該過程的分子機制和調控網絡如何仍是一個謎，有很多科學問題亟需我們解答。例如，miR156-SPL介導的從幼年到成年的轉換機制［36］和在植物避蔭綜合征的調控過程［68］，仍需繼續鑒定miR156上游的調控因子，從而闡明miR156如何通過同一下游因子進而調控不同的生物學過程的分子機制；TCP作為葉發育過程中的主要集線器，TCP-miRNA這個復雜的網絡是如何形成的；水稻中SPL9-miR528-RFI2途徑來調控開花時間［64］，還需要探究該途徑是否具有廣譜性，是否還參加了植物某些特有的重要生物學過程或性狀的形成，介導這些過程的分子機制又是如何發生的；在植物的進化過程中，決定miRNA結構差異的機制和靶基因特異性的分子機制目前亦尚不清楚。因此，非常有必要利用第二代測序技術以及不斷改進的miRNA研究方法，借助單細胞的各種組學和其他研究手段，借鑒模式植物miRNA的研究成果，miRNA的更多種類及其作用機理與調控途徑將會得到更清晰地闡釋，這將為理解miRNA如何調控植物生長發育提供重要的理論依據。