微生態制劑對烤煙連作土壤酶活性及其產量的影響

李 倩，張常興，程玉淵，劉 園，牛莉莉

(河南省煙草公司 南陽市公司，河南 南陽 473000)

土壤微生態制劑是一類以有益微生物為核心的生物制品，其中的功能微生物可通過分泌土壤酶、參與有機質降解和驅動養分循環等方式，改善土壤的理化及生物學性質，并通過競爭、拮抗、寄生及溶菌等作用抑制有害病原菌的侵染和繁殖，降低病害發生率，進而提升作物產量和品質[1-2]。盆栽試驗顯示，長期連作黃瓜土壤施用復合微生態制劑，土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性均顯著增強，黃瓜黃萎病的發生率明顯下降，土壤質量得到有效改善[3]。大田條件下含有EM菌(Effective Microorganisms)的微生態制劑可顯著提高連作地西洋參根際微生物數量，及脲酶和多酚氧化酶的活性，抑制土傳病害的發生，改良土壤環境，實現提質增產[4]。河南省是我國的烤煙主產區之一，植煙歷史悠久，連作現象普遍，土壤遭受嚴重破壞，如理化及生物學性質惡化、真菌性病害加重和生產力下降等諸多問題，造成煙葉產質量下降，嚴重阻礙了產區的可持續發展，亟需改良土壤，實現烤煙提質增產。木霉菌具有廣譜抑菌性，可通過寄生或拮抗作用殺滅29種病原真菌的生長[5-7]；芽孢桿菌通過快速定殖作用，能顯著干擾煙草黑脛病、根黑腐病及小麥全蝕病等病原菌的生長[8-11]；放線菌能夠分泌鏈霉素和多效霉素等多種抗生素，干擾病原真菌的代謝[12]。且這些微生物在生長過程中還能分泌多種有機酸、氫離子和植物內源生長調節劑等，活化土壤養分，促進作物生長。目前，微生態制劑在烤煙栽培上的應用鮮見報道，且微生物對地域環境具有選擇性，篩選適宜當地生態環境的微生態制劑具有重要意義。為此，試驗選擇放線菌、促生芽孢桿菌和木霉菌3種主要成分的土壤微生態制劑，研究其對連作煙田土壤酶活性、根際微生物活性及其病害發生與產量與經濟性狀的影響，旨在篩選出適于豫西南煙區土壤改良的微生態制劑，為其在生產上的推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 烤煙品種 為生產上的主栽品種云煙87。

1.1.2 微生態制劑 微生態制劑A(放線菌及多價陰離子活性物質復配，有效活菌數≥2.0×108cfu/g)、微生態制劑B(以防病促生芽孢桿菌為主的復合微生物菌劑，有效活菌數≥3.0×108cfu/g)和微生態制劑C(木霉菌為主的有益微生物及其次生代謝產物復合而成，有效活菌數≥2.5×108cfu/g)，均由西南大學植物保護學院提供。

1.1.3 根際土樣 根際土樣共計3份，每份由5個根際土樣混合而成。

1.1.4 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基、馬丁氏培養基、高氏一號培養基、Ashby無氮培養基、磷酸鈣+植酸培養基和鋁土礦培養基。

1.1.5 儀器 SRS-SD1000便攜式土壤呼吸分析儀，英國ADC公司生產。

1.2 試驗地概況

試驗地位于河南省鄧州市九龍鎮煙葉特色基地單元，坐標為東經111°50，北緯32°45′，海拔153 m，年均氣溫13.5℃，年均降雨量724 mm，年均日照時數1 935 h，平均無霜期229 d。供試土壤為當地典型、保水保肥性能強的潮土，采用烤煙-玉米種植制度，已連續種植烤煙3 a，田塊土壤板結嚴重，根莖類病害多發。土壤基礎理化性質：pH 6.19，有機質16.22 g/kg，全氮0.63 g/kg，全磷0.21 g/kg，全鉀9.51 g/kg，堿解氮94.02 mg/kg，速效磷13.34 mg/kg，有效鉀196.6 mg/kg。

1.3 方法

1.3.1 土樣采集 清除表層2 cm雜物，按“S”形取樣法隨機選取長勢一致的15株煙苗，采用抖根法獲得根際土壤，即將煙株連根拔起，抖掉根外圍土壤至50 g左右，收集剩余土壤，每5個土樣混合為1份樣品，共計3份樣品，自封袋封裝、標記后置于冰盒中冷藏，迅速帶回實驗室備測相關指標。

1.3.2 試驗設計 試驗共設4個處理。對照(CK)，不施用微生態制劑；T1，施用微生態制劑A；T2，施用微生態制劑B；T3，施用微生態制劑C。4次重復，小區面積100 m2(10 m×10 m)，行距1.2 m，株距55 cm，隨機區組排列。微生態制劑結合常規施肥施入，常規施肥：煙草專用復合肥450 kg/hm2(N∶P2O5∶K2O為10∶10∶20)，芝麻餅肥500 kg/hm2，硫酸鉀375 kg/hm2，硝酸鉀45 kg/hm2。其中，70%的鉀肥作基肥，30%的鉀肥在團棵期追施，各土壤微生態制劑按30 kg/hm2用量，隨復合肥和芝麻餅肥全部作基肥施用。烤煙于2017年4月20日移栽，其生長期不使用化學殺菌劑，其他操作均按照當地優質烤煙生產標準執行。

1.4 指標測定

1.4.1 土壤呼吸強度 根際土壤呼吸強度采用土壤呼吸分析儀測定。

1.4.2 根際土壤可培養微生物數的數量 取部分新鮮土樣，采用稀釋平板涂布法測定土壤可培養細菌(牛肉膏蛋白胨培養基)、真菌(馬丁氏培養基)、放線菌(高氏一號培養基)、自生固氮菌(Ashby無氮培養基)、磷細菌(磷酸鈣+植酸培養基)和鉀細菌(鋁土礦培養基)數目[13]；采用氯仿熏蒸法-0.5 mol/L K2SO4提取法測定土壤微生物量碳和微生物量氮，采用K2Cr2O7氧化法測定浸提液中的微生物量碳(MBC)，采用凱氏定氮法測定微生物生物量氮(MBN)[14]。

另取部分風干土樣，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶活性〔以24 h 后1 g 土壤中生成的葡萄糖(glucose)的mg數表示〕，采用苯酚鈉-次氯酸鈉顯色法測定脲酶活性〔以24 h 后1g 土中生成NH4+-N的mg數表示〕，采用TTC 比色法測定脫氫酶活性〔以24 h 后1 g 土中TPF(三苯基甲月替)的mg數表示〕，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性(以每h內1 g 土消耗0.1mol/L KMnO4的mL數表示)[15]。

1.4.3 土壤微生物代謝熵 土壤微生物代謝熵(qCO2)為土壤微生物基礎呼吸與微生物量碳的比值。

qCO2=土壤微生物基礎呼吸/微生物量碳[16]。

1.5 烤煙主要病害的發生情況

參照煙草病蟲害分級及調查方法[17]，在煙株打頂期(移栽后60 d)調查各處理煙株主要病害的發生情況，并計算烤煙發病率和病情指數。

發病率=(發病煙株數)/(調查總煙株數)×100%。

病情指數=100×Σ(各級病葉數×各級代表值)/(調查總葉數×最高級代表值)。

1.6 烤煙的產量及產值

煙葉烘烤后參照GB2635-1992《烤煙》對各處理煙葉進行分級、稱重，按照2017年當地煙葉收購價格，計算烤煙產量、產值和中上等煙比例。

1.7 數據處理

采用Excel 2007 處理數據，SPSS 20.0進行統計分析，Origin 8.5 作圖，Duncan's新復極差法進行差異顯著性檢驗，不同處理間差異性顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 根際土壤酶活性

從表1可見，微生態制劑能顯著提高根際土壤脫氫酶、脲酶和蔗糖酶的活性，但增幅因土壤酶的種類不同而異。其中，脫氫酶和脲酶的活性為T2>T1>T3>CK。T2蔗糖酶活性最高，達31.30 mg glucose/(g·d)，與其余處理間差異顯著(P<0.05)；T1次之，為25.72 mg glucose/(g·d)，T1與T3間差異不顯著；CK最低，僅14.94 mg/(g·d)。此外，與CK相比，3種微生態制劑對連作煙田土壤過氧化氫酶活性均無顯著影響。

2.2 根際土壤的微生物數量

從表2可知，煙田施用微生態制劑后，烤煙根際土壤中的可培養細菌、放線菌、自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌數量顯著增加，但真菌的數量變化則相反。與CK相比，T2的細菌、放線菌、自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌數量增幅最大，分別增加0.62倍、2.00倍、1.52倍、1.63倍和0.84倍，T1次之，T3最低；就真菌數量而言，T1、T2和T3烤煙根際土壤真菌分別較CK下降40.36%、58.38%和24.37%。

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP< 0.05 level.The same below.

表2 不同處理土壤微生物的數量變化Table 2 Effect of different treatment on soil microorganism quantity cfu/g DW

2.3 根際土壤微生物的活性

從圖1看出，T2的微生物量碳和呼吸強度(CO2)最高，分別為271.56 mg/kg和3.29 μg CO2/(g·h)，不同處理間依次為T2>T1>T3>CK(P<0.05)。不同微生態制劑處理微生物量氮均顯著高于CK，但T1和T2差異不顯著。T1和T3的微生物代謝熵均與CK 相比無顯著差異，而T2則顯著低于CK。說明，煙株根際土壤環境得到改善，微生物的生長與代謝活動增強。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significance of difference at P<0.05 level.圖 1 不同處理根際土壤微生物的活性Fig.1 Microbial activity in rhizosphere soils under different treatments

2.4 烤煙主要病害的發病率

從表3可知，T1和T2煙株黑脛病的發病率和病情指數均較CK顯著下降，分別降低54.59%和65.19%，但二者間差異不顯著(P<0.05)；T3煙株發病率較CK降低21.65%，但病情指數無顯著變化。此外，連作煙田增施3種土壤微生態制劑后，煙株根黑腐病的發病率和病情指數均顯著低于CK，T2降幅最大，分別下降44.41%和55.97%。說明在黑脛病和根黑腐病頻發的煙田中，增施3種微生態制劑可防治烤煙主要病害的發生。

表3 不同處理烤煙主要病害的發病率Table 3 Incidence rate of main diseases in tobacco under different treatments

2.5 煙葉經濟性狀

從表4可知，施用土壤微生態制劑可顯著提高烤煙的產量、產值和中上等煙比例，不同處理依次為T2>T1>T3>CK(P<0.05)。產量、產值和中上等煙比例，T1較CK分別提高33.97%、35.62%和25.38%，T2較CK分別提高25.44%、35.62%和18.46%，T3較CK分別提高15.05%、17.60%和9.19%。說明連作煙田施用微生態制劑，煙株根系對養分的吸收量增加，最終實現煙葉提質增產的目的。

表4 不同處理煙葉的產質量及中上等煙比例Table 4 Economic traits of tobacco leaves under different treatments

3 結論與討論

土壤酶主要由土壤中的微生物、植株根系及其殘體分泌，其參與土壤多種化學反應，驅動土壤新陳代謝，其活性的大小可動態指示土壤的健康程度[18]。麻耀華等[3]研究發現，復合微生態制劑可使黃瓜根際土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶的活性分別提高130.8%、190.5%和123.5%，土壤質量得到有效改良。任旭琴等[19]研究報道，在淮安紅椒連作10年土壤中施用枯草芽孢桿菌制劑，可顯著提高根際土壤脫氫酶、脲酶和堿性磷酸酶的活性，有效緩解連作障礙。研究結果表明，增施微生態制劑后連作煙田煙株根際土壤脫氫酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性顯著增強，表明煙田土壤質量提高。大量研究表明，土壤微生物的數量與脫氫酶和脲酶的活性呈顯著正相關，即微生物數量越多，單位時間內分泌的酶量越多，酶活性越強[20-21]。研究結果表明，煙田增施以防病促生芽孢桿菌為主要成分的微生態制劑(T2)后，土壤微生物數量最多(真菌除外)。可能是脫氫酶、脲酶和蔗糖酶3種土壤關鍵酶活性均顯著高于其余2個處理(T1和T3)的主要原因之一，也可能是促生芽孢桿菌分泌胞外酶及次級代謝產物的能力強于放線菌和木霉菌等[22-25]，致使土壤酶含量增加。微生物量碳(MBC)和微生物量氮(MBN)可以指示土壤C和N的轉化和貯存能力，直接反映作物生態體系的優劣。一定程度上，其值越大，代表土壤健康度越高[26-27]。微生物代謝熵(qCO2)是土壤基礎呼吸強度與微生物量碳的比值，反映土壤微生物對碳源的利用效率。代謝熵越小，微生物呼吸消耗的碳源就越少，用于構造生物體的碳源越多，碳源的利用效率升高[17]。優質適宜的土壤環境可增強微生物代謝活動，呼吸強度增加，代謝熵降低，碳源利用率提高[28-29]。煙田增施微生態制劑后，根際土壤微生物量碳氮增加，呼吸強度提高，但代謝熵卻有所下降。說明，微生態制劑可改善根際微生物的生長環境，促進根際微生物的能量代謝，提高碳源的利用率，細胞的構建速度加快，這是根際土壤細菌、放線菌、自生固氮菌、無機磷細菌和鉀細菌數量增加的主要原因之一。

烤煙長期連作，極易產生土壤有害真菌優勢種群，提高土壤真菌病害的發生率[30]，造成烤煙嚴重減產，部分地塊甚至絕收。研究結果表明，增施含放線菌、促生芽孢桿菌和木霉菌的微生態制劑后，土壤真菌數量、黑脛病及根黑腐病的發病率和病情指數均顯著下降，煙葉產量、產值和中上等煙比例明顯提高，與高峰等[31-32]的研究結果一致。說明，在黑脛病和根黑腐病高發的煙田可增施3種微生態制劑防治其病害的發生，降低病害損失率。此外，微生態制劑的防病效果因其所含微生物的種類不同而異。綜合來看，以促生芽孢桿菌為主的微生態制劑對煙田的改良效果最優，煙株黑脛病和根黑腐病的發病率最低，產量、產值和中上等煙比例最高。有研究發現，大多數芽孢桿菌在生長過程中，可通過分泌多種胞外酶、有機酸和氫離子等代謝產物，發揮促生、防病、抑菌和除臭等功效外[10,33]，一些芽孢桿菌還具有很強的定殖能力，其孢子不僅對非生物脅迫具有抗逆性，對于土著微生物群落也具有生物脅迫性，極易在土壤中形成優勢種群[34-35]，試驗中的促生芽孢桿菌也可能具備上述特性，其能夠快速在連作煙田中形成優勢種群，大量分泌次級代謝產物，殺滅或抑制土壤中的病原真菌，降低煙株的發病率；同時釋放多種酶、有機酸和氫離子活化土壤養分，促進煙株對養分的吸收，進而提高烤煙的產質量。

綜上所述，微生態制劑能顯著提高連作煙田土壤酶及根際微生物的數量與活性，減少真菌數量，降低煙株黑脛病和根黑腐病的發病率和病情指數，提高煙葉的產量、產值及中上等煙比例，但改良效果因其含有的微生物種類不同而異，以含促生芽孢桿菌的微生態制劑改良效果最優。因此，在烤煙栽培過程中，可通過增施含促生芽孢桿菌的微生態制劑改善連作煙田，降低真菌性病害發生率，提高烤煙的產質量。