CDK13基因對缺氧性腦損傷小鼠細胞凋亡的影響

王榮躍　魯文潔　邱海凡　戴芬

[摘要] 目的 研究CDK13基因對缺氧性腦損傷小鼠細胞凋亡的影響。 方法 將野生型和CDK13基因敲除型小鼠分別分為野生型假手術組（SWT）、野生型模型組（MWT）、基因敲除假手術組（SKO）及基因敲除模型組（MKO）。采用PCR反應法檢測CDK13基因表達、TTC染色法檢測腦梗死程度、免疫組化法檢測腦組織中活化型半胱天冬酶-3（CC3）表達、TUNEL法檢測細胞凋亡情況，四組小鼠進行相關指標比較。 結果 野生型模型組（MWT）小鼠腦組織梗死程度較基因敲除模型組（MKO）小鼠明顯減輕（P<0.05），且腦組織凋亡陽性細胞數明顯減少，凋亡指數降低，凋亡蛋白CC3表達減少（P<0.05）。 結論 敲除CDK13基因具有加劇小鼠缺氧性腦損傷的作用。

[關鍵詞] CDK13基因;基因敲除;細胞凋亡;模型

[中圖分類號] R722.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）34-0039-04

Effect of CDK13 gene on apoptosis in mice with hypoxic brain damage

WANG Rongyue1? ?LU Wenjie2? ?QIU Haifan1? ?DAI Fen1

1.Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China; 2.Outpatient Department， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China

[Abstract] Objective To study the effect of CDK13 gene on apoptosis in mice with hypoxic brain injury. Methods Wild type and CDK13 knockout mice were divided into wild type sham operation group （SWT）， wild type model group （MWT）， gene knockout sham operation group （SKO） and gene knockout model group （MKO）. The expression of CDK13 gene was detected by PCR reaction. The degree of cerebral infarction was detected by TTC staining. The expression of activated caspase-3 （CC3） in brain tissue was detected by immunohistochemistry. The apoptosis was detected by TUNEL method. Four groups of mice were compared. Results Compared with the MKO group， the degree of cerebral infarction in the MWT group was significantly reduced （P<0.05）， and the number of apoptotic positive cells， apoptotic index and CC3 expression were significantly decreased（P<0.05）. Conclusion Knockout of CDK13 gene aggravates hypoxic brain damage in mice.

[Key words] CDK13 gene; Gene knockout; Apoptosis; Model

智力障礙（mental retardation，MR）是指出現在18周歲之前以認知障礙和社會適應能力缺陷為主要表現的一種常見的出生缺陷疾病，在世界范圍內患病率約為1%～3%[1，2]。智力障礙嚴重危害兒童及青少年的身心健康，MR具有終生發病和不可治愈的特點，目前研究認為細胞壞死及凋亡是神經元細胞死亡的主要方式，同時研究發現腦缺氧神經元損傷有多種死亡機制參與[3，4]，但細胞凋亡發生的具體機制仍不清楚。

CDK13（cyclin-dependent kinases 13，CDK13）是最晚被發現的細胞周期依賴性激酶家族成員，該家族蛋白C端有一段20個ATP依賴的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結構，通過整合細胞內外的信號，實現細胞循環和基因轉錄過程的調控功能。CDK12和CDK13具有較多的同源序列，最近發現其可能在轉錄和加工RNA過程中發揮重要作用[3，4]。人類CDK13蛋白分子量較大，為165 kDa，已知CDK13與周期蛋白Cyclin K結合形成蛋白復合物可發揮生物學功能[6，7]。CDK13通過磷酸化絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2促進細胞凋亡[8]，在前期研究中發現CDK13基因缺失可導致智力障礙[9]，推測CDK13可能參與腦缺氧過程引起細胞凋亡。因此本研究以缺氧性腦損傷作為研究區域，采用線栓法建立新生鼠（MCAO）模型，探討CDK13基因敲除對小鼠缺氧性腦損傷細胞凋亡的影響。

2017年，Bostwic BL等[18]對一組CDK13新發突變患兒的臨床表型進行深入分析，發現CDK13變異可致患兒發生先天性心臟病、面容異常及智力發育障礙，但具體分子機制仍不詳。本研究發現，兩組假手術組小鼠之間神經元凋亡數目無差異，而CDK13基因敲除后凋亡明顯增加，提示CDK13基因敲除后可能通過激活其他路徑上的蛋白加重腦損傷，如JNK[20，21]、p53[22]、NF-κB[23，24]等，其在細胞凋亡中可能起重要作用，對深入闡明CDK13敲除引起小鼠腦組織損傷的作用機制具有重要意義。CDK13缺失可能導致小鼠突觸前谷氨酸等興奮性遞質的過度釋放，激活p38MARK，通過p21等表達影響細胞凋亡，降低缺氧小鼠腦神經細胞損傷。本研究同時觀察到敲除CDK13后能降低腦神經細胞凋亡的發生，與Wu HJ等[25]的報道基本符合。本研究發現CDK13基因敲除后小鼠腦組織凋亡程度較重，且凋亡蛋白表達明顯增加，提示神經細胞損傷增加，但這一路徑的中間過程仍有待下一步深入研究。

綜上所述，敲除CDK13基因具有加劇小鼠缺氧性腦損傷的作用，為明確智力障礙的原因提供了新思路，但具體分子機制需進一步研究闡明。

[參考文獻]

[1] Roehr B. American psychiatric association explains DSM-5[J]. BMJ，2013，346：f3591.

[2] Moeschler JB，Shevell M. Comprehensive evaluation of the child with intellectual disability or global developmental delays[J]. Pediatrics，2014，134（3）：e903-e918.

[3] Parikh P，Juul SE. Neuroprotective strategies in neonatal brain injury[J]. J Pediatr，2018，192：22-32.

[4] Wang JY，Xia Q，Chu KT，et al. Severe global cerebral ischemia-induced programmed necrosis of hippocampal CA1 neurons in rat is prevented by 3-methyladenine： A widely used inhibitor of autophagy[J]. J Neuropathol Exp Neurol，2011，70（4）：314-322.

[5] Malumbres M，Harlow E，Hunt T，et al. Cyclin-dependent kinases： A family portrait[J]. Nat Cell Biol，2009，11（11）：1275-1276.

[6] Chen HH，Wong YH，Geneviere AM，et al. CDK13/CDC2L5 interacts with L-type cyclins and regulates alternative splicing[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，354（3）：735-740.

[7] Greifenberg AK，Honig D，Pilarova K，et al. Structural and functional analysis of the Cdk13/Cyclin K complex[J].Cell Rep，2016，14（2）：320-331.

[8] Niemi NM，MacKeigan JP. Mitochondrial phosphorylation in apoptosis： Flipping the death switch[J]. Antioxid Redox Signal，2013，19（6）：572-582.

[9] 王榮躍，雷婷纓，符芳，等. 染色體微陣列分析技術在489例生長發育遲緩/智力低下患兒中的應用[J]. 中華醫學遺傳學雜志，2017，34（4）：528-533.

[10] Cho SE，Kim YM，Jeong JS，et al. The effect of ultrasound for increasing neural differentiation in hBM-MSCs and inducing neurogenesis in ischemic stroke model[J]. Life Sci，2016，165：35-42.

[11] Zhu J，Qu Y，Lin Z，et al. Loss of PINK1 inhibits apoptosis by upregulating alpha-synuclein in inflammation-sensitized hypoxic-ischemic injury in the immature brains[J]. Brain Res，2016，1653：14-22.

[12] Minami A，Nakanishi A，Matsuda S，et al. Function of alpha-synuclein and PINK1 in Lewy body dementia（Review）[J]. Int J Mol Med，2015，35（1）：3-9.

[13] Zhou Z，Fu XD. Regulation of splicing by SR proteins and SR protein-specific kinases[J]. Chromosoma，2013， 122（3）：191-207.

[14] Dixon BJ，Reis C，Ho WM，et al. Neuroprotective strategies after neonatal hypoxic ischemic encephalopathy[J]. Int J Mol Sci，2015，16（9）：22368-22401.

[15] Trinh J，Kandaswamy KK，Werber M，et al. Novel pathogenic variants and multiple molecular diagnoses in neurodevelopmental disorders[J]. J Neurodev Disord，2019， 11（1）：11.

[16] Lipp JJ，Marvin MC，Shokat KM，et al. SR protein kinases promote splicing of nonconsensus introns[J]. Nat Struct Mol Biol，2015，22（8）：611-617.

[17] Liang K，Gao X，Gilmore JM，et al. Characterization of human Cyclin-Dependent Kinase 12（CDK12） and CDK13 Complexes in C-Terminal domain phosphorylation， gene transcription，and RNA processing[J]. Molecular and Cellular Biology，2015，35（6）：928-938.

[18] Bostwick BL，McLean S，Posey JE，et al. Phenotypic and molecular characterisation of CDK13-related congenital heart defects， dysmorphic facial features and intellectual developmental disorders[J]. Genome Med，2017，9（1）：73.

[19] Hamilton MJ，Caswell RC，Canham N，et al. Heterozygous mutations affecting the protein kinase domain of CDK13 cause a syndromic form of developmental delay and intellectual disability[J]. J Med Genet，2018，55（1）：28-38.

[20] 韓琳，王洪新，魯美麗. 黃芪多糖通過抑制NF-κB和JNK信號通路減輕LPS誘導的小鼠心肌細胞凋亡[J]. 中國藥理學通報，2018，34（2）：243-249.

[21] Wang Q，Gan X，Li F，et al. PM2.5 exposure induces more serious apoptosis of cardiomyocytes mediated by caspase3 through JNK/P53 pathway in hyperlipidemic rats[J]. Int J Biol Sci，2019，15（1）：24-33.

[22] Tang R，Mei X，Wang YC，et al. LncRNA GAS5 regulates vascular smooth muscle cell cycle arrest and apoptosis via p53 pathway[J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2019，1865（9）：2516-2525.

[23] 丁丹，焦麗華， 王雪臣，等. 燈盞花素對大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡及NF-κB通路信號分子α7nAChR、p65、IkB-α的影響[J]. 中國循證心血管醫學雜志，2018，10（12）：1480-1483.

[24] Raish M，Ahmad A，Ansari MA，et al. Momordica charantia polysaccharides ameliorate oxidative stress， inflammation， and apoptosis in ethanol-induced gastritis in mucosa through NF-κB signaling pathway inhibition[J]. Int J Biol Macromol，2018，111：193-199.

[25] Wu HJ，Pu JL，Krafft PR，et al. The molecular mechanisms between autophagy and apoptosis： Potential role in central nervous system disorders[J]. Cell Mol Neurobiol，2015，35（1）：85-99.

（收稿日期：2019-06-17）