固氮微生物對鰻草植株生長及其根際土壤酶活性的影響?

張雪梅， 張秀梅, 2， 張沛東， 王 琦， 李文濤??

(1.海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266072)

隨著海草床生境退化的加劇及人們對其生態功能認識的加強，世界沿海國家相繼開展了海草床退化生境的修復工作，其中植株移植法是主要修復方法之一[1]，與此相關的研究報道多集中在移植方法[2-3]、移植時間[4]及環境因子對移植效果的影響[5-6]等方面，對于移植鰻草幼苗人工促繁策略的研究較少。而研究表明，合適的人工促繁手段能有效促進移植植株的繁殖、存活及生長[7]，這對于減少天然供體使用量、促進移植修復效果等具有極大的應用價值。

生物固氮在氮素的生物地球化學循環中發揮著重要作用。固氮微生物不僅能夠通過生物固氮作用將大氣中的氮氣轉化為含氮化合物，從而在一定程度上緩解氮缺乏對植物初級生產力的限制，其代謝產物在促進植物生長[8-9]、生物病害防治[10]等方面也具有顯著作用，目前已被廣泛應用于主要經濟及生態物種。Anjali等[8]研究證實，Aneurinibacillusaneurinilyticus具有除固氮功能外的多種植物促生特性且能顯著增加番茄(Solanumlycopersicum)營養吸收速率，促進番茄生長。姚拓等[11]利用穩定同位素稀釋法研究發現，固氮菌能顯著增加燕麥(Avenasativa)固氮量，促進燕麥生長。也有研究表明，海草葉片表面及根莖周圍同樣附著大量微生物，是海草床生態系統的重要組成部分[12]。但目前對海草床固氮微生物的研究多集中在群落組成和結構多樣性[13-14]、固氮量貢獻[15-16]及影響因素[17-18]等方面，而將固氮微生物應用于海草床退化生境修復的研究實例極少。

鰻草(ZosteramarinaL.)屬鰻草科(Zosteraceae)鰻草屬(Zostera)，主要分布在溫帶海域淺海區[19]。近年來由于自然環境變化和人類活動影響，全球范圍內鰻草資源嚴重衰退。本研究針對鰻草移植修復過程中的人工促繁問題，通過外源固氮菌接種實驗，探究其對鰻草植株存活、生長、生理及根際土壤酶活力的影響，為深入研究高效固氮菌株功能與代謝調控及其在鰻草植株人工促繁中的作用提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株 實驗用固氮菌菌株分離自山東省威海市天鵝湖鰻草根際土壤，其中Bacilusfirmus3A與Thalassospirasp. 4G為王琦等[12]分離保存于中國海洋大學資源增殖生態學實驗室的2株固氮菌株，菌株S3-2Y和菌株S3-4R經形態學、生理生化、nifH及16S rDNA測序確定分別為Bacillushemicentroti、Bacillusjeotgali，其具體指標見表1。

表1 4種固氮菌株的基礎指標

注：菌株Bacilusfirmus3A及Thalassospirasp. 4G固氮酶活性、最適生長溫度及最適生長鹽度數據引用自王琦等[12]。The nitrogen fixation rate, optimum growth temperature and salinity ofBacilusfirmus3A andThalassospirasp. 4G are quoted from Wang Qi et al[12].

1.1.2 培養基 選擇性無氮培養基參考Smith等[20]的配方并稍作調整，用于固氮菌株的活化和擴繁：七水硫酸亞鐵0.001 g，氯化鉀0.56 g，六水氯化鎂4.00 g，氯化鈉25.00 g，七水硫酸鎂4.80 g，磷酸氫二鉀0.01 g，三羥甲基氨基甲烷0.48 g，蛋白胨4.00 g，酵母粉2.00 g，甘油2.00 mL，超純水1 000 mL，pH=8.2。

1.1.3 鰻草植株 實驗用鰻草植株于4月25日采自山東省榮成市天鵝湖海域(36.43°N，122.26°E)。采集時，將植株從底部連根挖出，確保鰻草植株完整。植株經海水浸洗，去除底質、貝類及其他附生生物，移入盛有海水的泡沫箱中，24 h內移送回實驗室，于室外水槽中暫養3 d，暫養期間采用自然海水，平均鹽度為30.79，每日14：00時的平均水溫為19.85 ℃。

1.2 接種劑的制備

參考Ridvan等[21]的方法并稍作改進。將低溫保藏法保存的菌株快速置于35～40 ℃的溫水中，使其迅速融化。接種環蘸取少量菌液，用平板劃線的方法接種到固體無氮培養基中，30℃倒置培養18～24 h。挑取單菌落接種到含有50 mL液體無氮培養基的錐形瓶中，30 ℃，180 r/min震蕩培養24 h，然后用含有0.025%吐溫20的無菌水稀釋至109cfu/mL備用。

1.3 實驗設計

1.3.1 菌株間的拮抗反應測定 將4株菌株兩兩相交劃線接種于選擇性固體無氮培養基上，30 ℃倒置培養2～3 d，每天觀察交叉點出細菌生長情況。若交叉點處細菌生長狀況良好，表明2株固氮菌株可以混合培養；反之則表明菌株間有抑制作用，不能混合培養。

1.3.2 固氮菌接種實驗 實驗于2017年5—6月進行，共設6個處理(見表2)，每個處理設置8個重復，每個重復隨機選取長勢良好且具有相似形態學特征(株高15～20 cm，葉片數3～4，根狀莖4 cm)的10株鰻草植株，植于滅菌處理的聚乙烯塑料盒中，接種劑只于實驗初接種一次。鰻草盆栽實驗所需土壤取自于樣品采集地(威海市天鵝湖)，土壤及海水均經過滅菌處理。實驗在室外的玻璃水槽中進行，相同處理的每4個重復置于同一個玻璃水槽中且各組及重復每天隨機變換水槽擺放位置以減少光照誤差。實驗時，所有鰻草植株采用針孔法標記。針孔位置位于葉分生組織上方1 cm處。

表2 各處理組的接種方式

1.4 樣品的采集和測定

實驗持續30 d，期間每3 d換一次滅菌處理的海水。實驗結束后，觀察記錄鰻草植株的存活情況，計算各組存活率；各處理組隨機選取5株測定光合色素含量，鰻草葉片光合色素含量的測定采用萃取法[22]，即取每株植株1 cm2健康新鮮的新生葉片用二甲基甲酰胺(DMF)提取光合色素，然后用分光光度計進行測定；另隨機選取5株測定可溶性糖含量，即取待測鰻草植株的新生葉片于105 ℃烘箱中殺青后稱至恒重，加入乙醇、蒽酮試劑提取顯色后，測定625 nm波長下的吸光值[23]；余下植株測定新生葉長、葉寬、莖節長及地上和地下組織干重等生長指標，并計算單株新葉面積及地上和地下生產力，測定及計算方法參考Zhao等[24]。根系中土壤脫氫酶活力的測定采用氯化三苯基氮唑(TTC)還原法，用Solarbio土壤脫氫酶試劑盒(BC0395)進行；即每組隨機選取8份新鮮土壤，37 ℃，暗培養12 h；隨后冰浴5 min終止反應，加入丙酮提取后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液于485 nm處比色，以吸光值計算脫氫酶活力。根系土壤中脲酶和堿性磷酸酶活力的測定分別采用靛酚藍比色法和磷酸苯二鈉比色法，用Solarbio土壤脲酶試劑盒(BC0125)和土壤堿性磷酸酶試劑盒(BC0285)進行；即每組隨機取8份自然風干土樣經催化反應后，10 000 r/min常溫離心10 min，取上清液分別于630和660 nm處比色，以吸光值計算脲酶、堿性磷酸酶活力。

1.5 數據分析

數據均以平均值±標準誤(Mean±S.E.)表示，采用SPSS 17.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA),若差異顯著則進行Tukey多重比較分析組間差異。若數據不滿足正態性或方差齊性，先對數據進行轉換，再進行單因素方差分析；若轉換后仍不滿足，則進行非參數檢驗。顯著性水平α=0.05。分析結果使用origin 8.5軟件繪圖。使用Canoco 4.5軟件對植株各指標數據集進行去趨勢對應分析(Detrended correspondence analysis, DCA)，4個排序軸的梯度長度均小于3時選用基于線性模型的主成分分析(Principal components analysis, PCA)以識別不同菌株類型中植株生長及生理指標數據間的相似性和差異性。

2 實驗結果

2.1 菌株間的拮抗測定

拮抗測定是鑒別菌株間能否共生的傳統方法，4株菌株間的拮抗反應結果表明，4株固氮菌兩兩之間均不產生拮抗作用，可以混合培養。

2.2 固氮微生物對鰻草存活率的影響

鰻草植株存活率變化如圖1所示。與對照組相比，接種不同種類固氮微生物均能提高植株的存活率，增長范圍在30.00%～57.50%之間。除菌株S3-4R組外，其余處理組的存活率均顯著高于對照組(P<0.05)，但各處理組間無顯著差異(P>0.05)。

(誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05) ，橫坐標中Control表示不接種菌株的對照組。Different letters on the error bars indicate significant differences between the different groups (P<0.05)， The control group had no strain inoculated.)

圖1 不同固氮菌株對鰻草植株存活率的影響

Fig.1 Effect of different nitrogen-fixing bacteria on the survival ofZosteramarinaL. plants

2.3 固氮微生物對鰻草生長指標的影響

鰻草單株新葉面積的變化如圖2A所示。與對照組相比，接菌處理組能夠有效促進鰻草葉片生長，增長范圍在11.87%～66.56%之間。最高值出現在菌株4G處理組，單株新葉面積高達(63.26±3.21) cm2·shoot-1，是對照組((37.98±3.76) cm2·shoot-1)的1.67倍。另外菌株3A、4G和Mix處理組的單株新葉面積顯著高于對照組和菌株S3-2Y處理組(P<0.05)，且菌株4G處理組的單株新葉面積顯著高于菌株S3-4R處理組(P<0.05)，而與菌株3A和Mix處理組間無顯著差異(P>0.05)。

鰻草新莖節長的結果如圖2B所示。與對照組相比，接菌處理組能夠促進鰻草莖節的生長，但不同種類菌株作用效果不同。菌株3A、4G和Mix處理組的增長效果最明顯，新莖節長分別為11.95±0.96、13.79±0.58和(11.22±0.68) mm，顯著高于對照組的(8.26±0.76) mm (P<0.05)。鰻草新根長的結果如圖2C所示。接種固氮微生物能夠在一定程度上促進鰻草根的生長，增長范圍在8.84%～15.81%之間，但與對照組間并無顯著差異(P>0.05)。

鰻草植株生產力的結果如圖2D所示。菌株3A和4G處理組植株地上生產力高達4.72±0.29和(4.77±0.24) mg·shoot-1·d-1，與對照組相比分別增加了29.37%和30.30%，顯著高于對照組和其余各組(P<0.05)。地下生產力結果顯示，各處理組均顯著高于對照組(P<0.05)，其中菌株4G處理組在各處理組中的地下生產力最高，達(0.74±0.04) mg·shoot-1·d-1，菌株S3-2Y處理組最低，為(0.55±0.04) mg·shoot-1·d-1，而對照組僅為(0.38±0.06) mg·shoot-1·d-1。

(A: 單株新葉面積New leaf area per shoot; B: 新莖節長New internode length; C: 新根長New root length; D: 生產力Productivity。 誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05)，橫坐標中Control表示不接種菌株的對照組。 Different letters on the error bars indicate significant differences between the different groups (P<0.05)， The control group had no strain inoculated.)

圖2 不同固氮菌株對鰻草植株生長指標的影響。

Fig.2 Effect of different nitrogen-fixing bacteria on growth status ofZosteramarinaL. plants

2.4 固氮微生物對鰻草生理指標的影響

鰻草葉片光合色素及可溶性糖含量的結果如圖3所示。固氮微生物對植株葉片葉綠素a和b含量的影響不顯著(P>0.05，見圖3A和3B)，但均顯著增加鰻草植株葉片中總葉綠素含量(P<0.05，見圖3C)，其中最大值出現在菌株3A處理組，為(67.94±4.99) μg·cm-2。固氮微生物對植株葉片中類胡蘿卜素含量的影響最顯著，各處理組葉片中類胡蘿卜素含量均顯著高于對照組(P<0.05，見圖3D)，其中最高值仍出現在菌株3A處理組((9.90±0.54)μg·cm-2)，是對照組((5.34±0.98) μg·cm-2)的1.85倍。所有處理組的可溶性糖含量均顯著高于對照組(P<0.05)。其中，菌株3A和4G處理組植株葉片中可溶性糖的含量也顯著高于其余處理組，最高值出現在菌株3A處理組((103.72±4.22) mg·g-1)，為對照組((54.06±2.61) mg·g-1)的1.92倍。

2.5 固氮微生物對土壤脫氫酶、土壤脲酶和土壤堿性磷酸酶活力的影響

4種固氮菌及其組合接種后鰻草根際土壤中脫氫酶活力如圖4A所示。各處理組的脫氫酶活力均顯著高于對照組(P<0.05)，其中最高值出現在菌株3A處理組((5.58±0.24) U·g-1·h-1)，為對照組((1.74±0.09) U·g-1·h-1)的3.21倍。同時菌株3A和4G處理組的脫氫酶活力也顯著高于其余3個處理組(P<0.05)。各處理組脲酶活力也有顯著提高(P<0.05，見圖4B)，其中最高值仍出現在菌株3A處理組((155.06±1.21) U·g-1)，為對照組的1.62倍，也顯著高于菌株上S3-2Y處理組，但菌株S3-2Y處理組與其余3個處理組間無顯著差異。4種固氮菌及其組合接種后，堿性磷酸酶活力與對照組差異不顯著(P>0.05，見圖4C)。

(A: 葉綠素a含量Chlorophyllacontent; B: 葉綠素b含量Chlorophyllbcontent; C: 總葉綠素含量Total chlorophyll content; D: 類胡蘿卜素含量Carotenoid content; E: 可溶性糖含量 Soluble sugar content。 誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05)，橫坐標中Control表示不接種菌株的對照組。 Different letters on the error bars indicate significant differences between the different groups (P<0.05)， The control group had no strain inoculated.)

圖3 不同固氮菌株對鰻草葉片光合色素和可溶性糖含量的影響

Fig.3 Effect of different nitrogen-fixing bacteria on photosynthetic pigments and soluble sugar content ofZosteramarinaL. leaves

2.6 菌株類型與鰻草植株生長生理指標的關系

運用去趨勢對應分析(DCA)，將菌株類型與鰻草10個生長生理指標相結合進行分析(見表3)，第一、第二排序軸對植株各指標的累計解釋量為63.30%，4個排序軸中梯度長度最大值為0.07。因此采用主成分分析(PCA)方法進行下一步分析，并對數據進行中心化和標準化處理，結果如圖5所示。結果表明，第一、二、三、四排序軸的解釋量分別為63.79%、19.82%、10.14%和3.40%，其中第一、第二排序軸的累計解釋量為83.61%(見表4)。在PCA分析圖中，選取的10個生長生理指標用箭頭表示，以菌株間的距離表示菌株作用效果的差異性，以指標間夾角的余弦值表示指標間的相關性強弱，以菌株類型在射線投影點到實心箭頭處的相對距離為準，進行排序。分析結果說明，5個處理組的植株促生效果大體呈現4G>3A>Mix>S3-2Y>S3-4R。菌株3A對鰻草光合色素的影響最為顯著，而菌株4G對鰻草生長指標的影響最為顯著。從各指標間的相關關系中可以看出，地上組織與地下組織各指標間的相關性較強，而光合色素與地下組織間的相關性較弱。此外，存活率與地上、地下組織及光合色素間均呈現較強的相關關系。

(A: 土壤脫氫酶Soil dehydrogenase; B: 土壤脲酶Soil urease; C: 堿性磷酸酶活力Soil alkaline phosphatase; 誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05)，橫坐標中Control表示不接種菌株的對照組。 Different letters on the error bars indicate significant differences between the different groups (P<0.05)， The control group had no strain inoculated.)

圖4 不同固氮菌株對鰻草根際土壤酶活力的影響

表4 鰻草植株生長及生理指標的PCA結果

3 討論

3.1 固氮微生物對鰻草的促生長作用

氮素是植物生長發育所需的重要元素，與氨基酸等細胞物質合成及其他重要生理過程密切相關[25]。研究表明，在植物種苗階段接種固氮菌能顯著增加植株存活率，促進植物生長，促生效果與固氮菌的固氮酶活性、生理代謝過程、環境條件等因素有關[8,26-27]。本實驗研究了4種固氮菌及其組合對鰻草的促生長作用，結果顯示，所有菌株及組合均能在一定程度上提高鰻草植株的存活率、單株新葉面積、莖節長及地上和地下生產力，但不同種類菌株的作用效果不同。菌株3A、4G、S2-2Y和Mix處理組能夠顯著提高鰻草植株存活率。在單株新葉面積、新莖節長、地上生產力等生長指標方面，菌株3A、4G和Mix表現出明顯優勢。而接種后增長效果最明顯的是植株地下生產力，所有處理組均顯著高于對照組。綜合所有生長指標，菌株4G的作用效果最為顯著，存活率、單株新葉面積、新莖節長、地上及地下生物量與對照組相比分別增加57.5%、66.6%、66.9%、42.2%和97.7%。通常固氮酶活性強弱是表征固氮微生物作用效果的主要依據。但本研究結果表明，菌株固氮酶活性的強弱與其作用效果并不總呈正相關。菌株3A、4G、S3-2Y和S3-4R的固氮酶活性分別為252.21、196.31、156.47和132.21 nmol C2H4·mL-1·h-1。但菌株3A的促生效果卻略低于菌株4G，這與Banik等[28]在野生水稻中的研究結果相一致。說明固氮作用受多種因素的影響，不能單一以固氮酶活性強弱衡量。由于實驗在室外開展，分析認為除固氮酶活性外，環境因素是影響固氮菌作用效果的重要原因。另外，混合接種處理組并未表現出協同作用效果。王錢崧等[29]研究了3種固氮菌株及其組合對甘蔗的促生長作用，發現接種效果會因組合方式不同而有所差異；而Ravikumar等[30]研究表明，同種組合對不同物種的促生效果也不盡相同。由于微生物間的競爭等原因，混合接種仍需通過進一步實驗以確定菌株的最優組合及配比。

圖5 菌株類型與鰻草生長生理指標的PCA排序圖

3.2 鰻草植株對接種固氮菌的生理響應

光合色素是植物光合作用的物質基礎，其中葉綠素a和葉綠素b廣泛存在于高等植物中，具有捕獲光能、驅動電子轉移的功能[31]；類胡蘿卜素作為光合作用中的輔助色素，能夠吸收、傳遞電子、清除光合作用產生的自由基[32]。已有研究證實可溶性氮含量能夠影響植物的光合特性[33]。本研究結果顯示，所有處理組均能顯著增加葉片中總葉綠素和類胡蘿卜素含量，其中菌株3A處理組的總葉綠素和類胡蘿卜素含量提升至對照組的1.58和1.84倍。董俊德等[34]亦發現深海海旋菌(ThalassospiraprofundimarisQ25-2)能夠提高泰來藻(Thalassiahemperichii)葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量。但菌株4G處理組的光合色素含量略低于其余處理組，結合其生長指標數據分析認為，菌株4G的促生速率可能較其余處理組更快，該結果是本實驗采樣節點超過其最佳生長期所致。因此，在鰻草植株人工促繁過程中除明確不同菌種的促生效果、確定最適應用菌株外，還需確定菌株最佳作用時間。另外，接種固氮微生物能顯著增加鰻草葉片中可溶性糖的含量。在高等植物中，可溶性糖不僅是能源物質，其在調節植物生長發育[35]、參與細胞內信號調節和傳導[36]等過程中也發揮重要作用。李紅梅等[37]研究發現，春季施加氮肥能夠增加小麥(TriticumaestivumL.)葉片中可溶性糖含量，從而改善其碳代謝能力，提高產量。袁淑珍等[38]通過低溫脅迫實驗證實，可溶性糖能夠提高螺旋藻(Spirulina)細胞的滲透調節能力，拓寬其溫度適應范圍。分析認為，接種固氮微生物可能通過調節鰻草葉片中可溶性糖含量促進鰻草植株生長，但具體的作用機制有待進一步探究。

3.3 固氮微生物對鰻草根際土壤酶活力的影響

土壤酶主要由植物根系分泌物、動植物殘體分解釋放的酶和土壤微生物酶類構成，是分析根際微生物對土壤生態過程影響機制的重要指標[39-40]。本研究結果表明，接種固氮微生物能夠增加土壤脫氫酶、脲酶、堿性磷酸酶活力，但不同菌株的作用效果不同。脫氫酶可以反映土壤體系內活性微生物量，是微生物氧化活性能力的精確指標[41]。本研究中發現，菌株3A和4G處理組的脫氫酶活力高達5.58和5.44 U·g-1·h-1顯著高于對照組和其余各組(P<0.05)。這與Chen等[42]的研究結果一致，表明實驗接種的固氮菌已成功定植于鰻草根際周圍，并進行了一系列生物化學反應，與生長及生理指標的提高與改善相對應。脲酶、堿性磷酸酶等水解酶類活力的高低直接影響土壤中氮、磷的分解轉化及其生物有效性，是表征土壤氮、磷等養分循環的指標之一[43-44]。但Sinsabaugh等[45]研究表明，不同類型生境對外源氮元素輸入的響應不同；而張藝等[46]通過模擬氮沉降實驗證實不同施氮類型及水平對土壤酶活性的影響也有差異。本文結果證實，4株固氮菌及其組合能有效提高鰻草與根際土壤間的氮素循環，促進鰻草植株生長，但對磷素分解轉化效果不顯著。陳勝男等[47]通過盆栽實驗同樣得出，接種自生固氮菌并不能顯著提高玉米根際土壤堿性磷酸酶活性。由此可見，土壤酶活力對外源物質輸入的響應不同，需根據不同類型及水平具體分析。

生物固氮作用受環境中微生物的競爭、結合態氮氧、植物基因型和環境條件變化等諸多影響會產生不同接種效果[47]。通過在鰻草根際固氮菌接種實驗也表明，4株固氮菌及其組合菌劑對鰻草存活、生長、生理及土壤酶活性的作用效果不同，與固氮酶活性并不直接相關。本研究采用原生沉積物滅菌環境開展實驗，以為減少環境中其他微生物影響同時保證土壤中其他元素含量與海區環境相同。但在實際應用過程中，環境復雜多變，為確保固氮菌在自然環境中的競爭適應能力，篩選最佳接種方式，確保接種穩定性等仍是今后需深入研究的課題。

4 結語

通過室外盆栽實驗，探究了4株固氮菌及其組合菌劑對鰻草植株生長的影響。結果表明，5個接菌處理組鰻草植株的存活、生長、生理及根際土壤酶活力等指標均有不同程度提高或改善。植株促生效果表現為4G>3A>Mix>S3-2Y>S3-4R，其中菌株3A、4G在海草床生態系統恢復中具有較高的應用價值，具備進一步研制固氮微生物肥料的潛力。