海洋酸度變化下孔石莼對農藥硫丹的生態響應研究?

李曉東， 譚海麗， 尤 宏,2??

(1.哈爾濱工業大學(威海)海洋科學與技術學院，山東 威海 264200；2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院環境科學與工程系，城市水資源與水環境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150090)

海洋酸化是指由于海洋吸收、釋放大氣中過量的二氧化碳，導致海水逐漸變酸的過程。聯合國政府間氣候變化委員會(IPCC)第五次評估報告指出：自工業革命以來，海水pH 值已下降了0.1 個單位，相當于氫離子質量分數增加了26%[1]，海洋酸化成為繼“溫室效應”之后又一由CO2過量排放而引起的全球性環境問題。

隨著農業生產的迅速發展，環境中農藥殘留問題日漸引起廣泛關注。其中硫丹是一種廣譜有機氯殺蟲劑，1954年由德國Hoechst 公司研制開發，因具備良好的胃毒和觸殺作用，曾被廣泛的運用在農業谷物、蔬菜、水果、棉花、林木等病蟲害防治[2]，2011年4月29日硫丹被列入斯德哥爾摩公約禁用物質列表，目前世界上已有60多個國家禁止使用，但由于過去幾十年硫丹的大量使用加上其潛在的遷移能力，全球范圍內各種環境介質中，如大氣、土壤、沉積物、水體均已普遍檢測出硫丹，中國從2003年在部分水體中就檢出硫丹[3-6]。

同時硫丹對水生生物有極高的毒性，并且隨著海洋酸化的加劇，海水pH值的降低會導致海水中硫丹溶解度的增加，降解速度的減緩，對海洋生物的生態毒性效應將會進一步增強。2017年2月2日，我國環境保護部環境保護對外合作中心與聯合國開發計劃署(UNDP)共同開發的 “中國硫丹淘汰項目”獲得全球環境基金(GEF)批準。表明硫丹對生物的毒害性已引起國際社會和政府的廣泛關注。

目前國內外對硫丹的研究，主要集中在對動物的毒性效應，如在高等哺乳動物和部分魚類[7-9]，而對于水生浮游植物的毒性研究較少；硫丹有著較強的生態毒性，并且隨著海洋酸化現象日趨嚴重，硫丹的理化性質也受到了影響，如硫丹的溶解度隨海水 pH 值的降低而增大，并且在低 pH 環境下硫丹在水中的半衰期增大，降解速率變緩。大型海藻是海洋中初級生產力的重要組成部分，在不到海洋總面積1%的沿岸帶構成海洋總初級生產力的10%，在近岸碳循環方面起著至關重要的作用，還可為海洋中的無脊椎動物及魚類提供產卵孵化和棲息的場所，而人類活動導致的環境變化問題正逐漸加劇，因此研究硫丹和海水酸度變化耦合作用對大型海藻的影響有著深遠的意義。本文以綠藻門的孔石莼(UlvapertusaKjellman)為研究對象，考察了硫丹單獨脅迫及其與酸度聯合脅迫下對孔石莼在個體及生理生化方面的影響，為今后減輕硫丹對大型海藻及海洋生態系統的危害提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗中的大型海藻孔石莼均采自威海市三連島潮間帶海域(海水pH=8.1 ，溫度16 ℃，鹽度31)。采集時選擇健康一致的藻體，放在盛有少量海水的塑料袋中于2 h內運至實驗室，選擇生長良好的藻體，洗凈附著的泥沙和浮游生物，其中將孔石莼打成直徑1.5 cm的圓片，在實驗室溫度(20 ℃)及光照條件(光照周期為L∶D = 12 h∶12 h)下放入5 L玻璃缸中馴養采用滅菌后的陳海水(pH=8.2鹽度31)，每天24 h曝氣。馴養4 d后進行正式實驗。

1.2 試劑與儀器

硫丹 EC 乳油，有效含量為 35%，購自于河北省冀州市凱明農藥有限責任公司。實驗前用蒸餾水配成有效含量為 10 mg·L-1的母液，實驗時按所需質量濃度進行稀釋。其余試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產。

電子天平(臺衡MP200A，中國)、實驗室pH計(METTLER TOLEDOFE20，瑞士)、立式自動壓力蒸汽滅菌器(致微GI54T，中國)、潔凈工作臺(安泰SW-CJ，中國)、紫外-可見分光光度計(尤尼柯TU-1800S，中國)、臺式高速冷凍離心機(利康Neofuge BR，中國香港)。

1.3 實驗設計

根據海水實際酸度，設定2個pH梯度，分別為7.9和8.2；根據硫丹預實驗，設置濃度梯度為0、50、150、250、350 μg/L的硫丹實驗組及pH聯合脅迫實驗設置如表1所示，每個處理組中設置3個平行樣，在超凈工作臺內每組接種孔石莼1.3 g左右，實驗周期為7 d，每天用0.01 mol/L NaOH和0.01 mol/L HCl溶液調節各處理組培養液的pH。

表1 硫丹及pH聯合脅迫實驗各處理組的設計Table 1 Design of endosulfan and pH stress experiment treatment groups

Note:①Groups；②Endosulfan concentration

1.4 孔石莼生長情況的測定

各實驗組分別于暴露第1天、第3天及第7天測定孔石莼藻體鮮重的變化，孔石莼葉片稱量前用吸水紙吸干。根據公式(1)計算孔石莼的相對生長率：

相對生長率(%) = [ ln(Wt/W0) /t]×100%。

(1)

其中：W0為初始濕重；Wt為td后的濕重。

1.5 葉綠素含量的測定

各實驗組，分別于暴露第1、3、7天取出藻體0.2 g，放入預冷的研缽，加入少量石英砂和碳酸鎂粉后在冰浴上研磨，之后加入10 mL 95%乙醇，在4 ℃冰箱中避光提取24 h，提取完畢在4 000 r/min 下離心 20 min，測定上清液在665、649和470 nm波長下的吸光度，并計算光合色素的含量。葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素濃度計算公式如下：

Ca=13.95A665-6.88A649；

(2)

Cb=24.96×A649-7.32×A665；

(3)

Cx·c=4.08A470+3.31A665-11.64A649。

(4)

其中：Ca為葉綠素a的濃度；Cb為葉綠素b的濃度；Cx·c為類胡蘿卜素的濃度；A665、A649和A470為665、649和470 nm的吸光度值。

1.6 抗氧化酶活力的測定

每個處理組分別于暴露第1天、第3天及第7天另取孔石莼葉片0.2 g，于預冷的研缽中加1 mL預冷的磷酸緩沖液(pH=7.8)在冰浴上研磨成漿，加磷酸緩沖液使體積為5 mL，于4 000 r/min下離心20 min后，取上清液測定蛋白質含量及酶活力。

SOD活性的測定采用Bewley等[10]改進的氮藍四唑(NBT)光化學反應法，POD活性的測定采用 Srivestava[11]等改進的愈創木酚法。可溶性蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法進行[12]。

1.7 數據處理

實驗結果以平均值±標準差(Mean±SD) 表示，采用 SPSS 19.0軟件對硫丹單獨脅迫后的實驗結果進行單因素方差分析，對硫丹脅迫后與pH耦合的實驗結果進行多因素方差分析，分析硫丹、pH及硫丹于pH耦合后對孔石莼個體及生理生化方面的影響。設置顯著水平為P<0.05，極其顯著水平為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 硫丹脅迫及與pH耦合對孔石莼生長的影響

2.1.1 硫丹對孔石莼生長的影響 圖1為硫丹對孔石莼相對生長率的影響。由圖可知，隨著硫丹濃度的逐漸升高，孔石莼的相對生長率在第1天和第3天時均出現了顯著的先升高后下降的趨勢。對照組在第3天相對生長率升高了22.73%，而在第7天變化則不明顯。與對照組相比，各濃度處理組的相對生長率在第1天分別變化了98.45%、61.56%、-49.85%、-124.15%，在第3天分別變化了86.25%、27.99%、-92.99%、-169.59%，在第7天則分別變化了13.96%、-14.37%、-132.92%、-195%。由此可以看出，50 μg/L的處理組在第1天和第3天相對生長率得到明顯促進，而在第7天基本上沒有促進作用；250和350 μg/L處理組孔石莼的相對生長率均出現明顯的抑制作用(P<0.01)，并且抑制作用隨著暴露時間的延長而逐漸加劇。250 μg/L處理組孔石莼相對生長率從第1天至第3天下降了82.84%，第3天至第7天下降了551.33%，在第7天時出現了負增長現象，藻體葉片變薄并且表現出白化現象，而高濃度350 μg/L處理組的孔石莼在脅迫第1天就已出現了負增長，至第七天孔石莼葉片已表現出顏色變白、腐爛和非常易碎等癥狀。

圖1 硫丹對孔石莼相對生長率的影響Fig.1 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on relative growth rate (RGR) of Ulva pertusa

2.1.2 硫丹與pH耦合對孔石莼生長的影響 圖2為pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼相對生長率的影響，所有低pH的處理組與對照組相比都具有極顯著性(P<0.01)的差異。在環境pH和低pH條件下孔石莼受硫丹脅迫相對生長率都表現為低濃度促進高濃度抑制效應，并且均在50 μg/L處理組時相對生長率值達到最高峰。硫丹脅迫第1天，與對照組相比，環境pH和低pH的各濃度處理組分別變化了98.45%、61.56%、-49.85%、-124.15%和84.70%、222.43%、117.42%、-51.63%、-123.94% 。說明在硫丹暴露第1天時，孔石莼的相對生長率在低pH條件下受到的促進作用更明顯，并且在L-0 μg/L處理組的相對生長率與對照組相比也表現為上升趨勢。在暴露第3天時，各處理組分別變化了86.25%、27.99%、-92.99%、-169.59%和81.60%、262.55%、106.95%、-92.55%、-177.07%。說明在低pH條件下暴露第3天時，孔石莼的相對生長率受到硫丹的脅迫作用更顯著，低濃度的刺激作用和高濃度的抑制作用更加明顯。至暴露第7天，各處理組分別變化了13.96%、-14.37%、-132.92%、-195%和69.61%、187.64%、43.42%、-140.37%、-201.95% 。隨著時間的延長，暴露第七天所有處理組孔石莼的相對生長率相對于第1天和第3天均有所下降。

pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼生長主體間效應的檢驗后發現，暴露第1天、第3天及第7天硫丹、pH以及兩者的交互作用對孔石莼的生長都發揮了作用，并且具有極其顯著的影響(P<0.01)。

2.2 硫丹脅迫及與pH耦合對孔石莼光合色素的影響

2.2.1 硫丹對孔石莼光合色素的影響 圖3為硫丹對孔石莼葉綠素a含量的影響。在硫丹暴露第1天、第3天和第7天，低濃度50 μg/L處理組的葉綠素a含量都表現出一致的促進作用，隨著硫丹濃度的增加，其他各濃度處理組呈現不同程度的抑制作用；隨著硫丹脅迫時間的延長，各濃度處理組的下降幅度不同，第1天至第3天，50和150 μg/L處理組葉綠素a的含量與對照組一樣無明顯變化趨勢。250和350 μg/L處理組在整個暴露期間表現出持續的下降趨勢，與對照組相比均表現出極顯著性差異(P<0.01)，說明高濃度硫丹對孔石莼葉綠素a有較大的損傷。在第3天，50 μg/L濃度處理組出現葉綠素a含量的最高峰值，至第7天后則出現了明顯下降，但與對照組相比，沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖2 pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼相對生長率(RGR)的影響Fig.2 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on relative growth rate (RGR) of Ulva pertusa

圖3 硫丹對孔石莼葉綠素a含量的影響Fig. 3 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on Chlorophyll a content of Ulva pertusa

圖4為硫丹對孔石莼葉綠素b含量的影響。與第1天相比，各濃度組第3天葉綠素b的含量分別變化了2.8%、2.26%、1.15%、-4.73%、-15.68%，至第7天葉綠素b的含量分別變化了-13.29%、-13.95%、-6.88%、-17.66%、-30.46%。隨著硫丹濃度的增加和暴露時間的延長，葉綠素b受到的抑制作用越來越明顯，具有明顯的劑量-時間效應。50 μg/L處理組的孔石莼在3個階段均表現出明顯的促進作用，表明一定濃度的硫丹農藥會促進孔石莼葉綠素b的合成和積累，之后葉綠素b含量開始回落，隨著硫丹濃度的增加而逐漸降低。

類胡蘿卜素不僅是藻類的主要捕光色素，也是生物體中的一種抗氧化劑，對細胞具有保護作用，使生物細胞免受外界不良因子的傷害。由圖5可知，在硫丹脅迫后的第1天，與對照組相比，僅350 μg/L處理組的類胡蘿卜素含量表現出極顯著性差異(P<0.01)，其余處理組沒有顯著性差異(P>0.05)。然而隨著硫丹脅迫時間加長，各濃度處理組逐漸表現出明顯的差異性，至暴露第7天時，各硫丹處理組均出現極顯著性差異(P<0.01)。說明硫丹脅迫下，孔石莼中類胡蘿卜素的響應具有明顯的時間依賴效應。

圖4 硫丹對孔石莼葉綠素b含量的影響Fig.4 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on Chlorophyll b content of Ulva pertusa

圖5 硫丹對孔石莼類胡蘿卜素含量的影響Fig.5 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on Carotenoids content of Ulva pertusa

2.2.2 硫丹與pH 耦合對孔石莼光合色素的影響 pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼葉綠素a含量的影響如圖6所示，環境pH與低pH條件下，各處理組孔石莼葉綠素a含量都表現為先升高后下降的趨勢，并且低pH的各處理組與環境pH相比，孔石莼葉綠素a的含量相對下降。環境pH與低pH處理組均在暴露第3天50 μg/L處理組出現葉綠素a含量的峰值，并且與對照組相比，環境pH下的葉綠素a的含量升高了12.54%，然而低pH條件下的葉綠素a的含量是相對下降的。在低pH硫丹處理組，除了第7天的L-50 μg/L處理組之外，其余各處理組與對照組相比都顯現出顯著的差異性(P<0.05)。L-0 μg/L處理組與對照組相比，葉綠素a的含量在第1天、第3天和第7天分別下降了21.66%、20.92%、52.69% 。表明在pH為7.9時孔石莼葉綠素a的含量是下降的。

圖6 pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼葉綠素a的影響Fig.6 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on Chlorophyll a contentof Ulvapertusa

pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼葉綠素a主體間效應的檢驗后發現，暴露第1天、第3天和第7天，硫丹、pH對孔石莼葉綠素a含量均具有顯著性影響(P<0.05)，而硫丹與pH的交互作用對孔石莼葉綠素a的影響較小，僅在脅迫后的第3天發揮顯著性效應(P<0.05)，第1天和第7天均無顯著性差異(P>0.05)。

圖7為pH與不同濃度的硫丹耦合對孔石莼葉綠素b含量的影響。環境pH與低pH條件下，各處理組孔石莼葉綠素b含量都表現為先升高后下降的趨勢，均在50 μg/L硫丹濃度時上升，環境pH的50 μg/L濃度是在第3天出現葉綠素b含量的峰值，低pH的50 μg/L濃度是在第1天出現葉綠素b含量的峰值，并且低pH的各處理組與環境pH相比，孔石莼葉綠素b的含量相對下降。在低pH硫丹處理組，除暴露第1天L-0和L-50 μg/L處理組之外，其他各處理組與對照組相比都有顯著的差異性(P<0.05)。L-0 μg/L處理組與對照組相比，葉綠素b的含量在第1天、第3天和第7天分別下降了24.98%、21.20%、30.29% ，說明在pH為7.9的條件下孔石莼葉綠素b的含量是下降的。

pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼葉綠素b主體間效應的檢驗后發現，暴露第1天、第3天和第7天，硫丹、pH對孔石莼葉綠素b含量都具有顯著性影響(P<0.05)。硫丹與pH的交互作用僅在脅迫后的第3天發揮顯著性效應(P<0.05)，第1天和第7天均無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼葉綠素b的影響Fig.7 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on Chlorophyll b contentof Ulvapertusa

由圖8可知，環境pH以及低pH條件下，各處理組孔石莼類胡蘿卜素含量都表現為先升高后下降的趨勢，均在50 μg/L處理組上升，并且在第3天達到最大值。低pH的各處理組與環境pH相比，孔石莼類胡蘿卜素的含量相對下降。在低pH條件下，除了L-50 μg/L和暴露第1天的L-150 μg/L處理組之外，其他各處理組與對照組相比呈現出顯著性差異(P<0.05)。L-0 μg/L處理組與對照組相比，類胡蘿卜素的含量在第1天、第3天和第7天分別下降了19.45%、11.62%、38.54% 。說明孔石莼體內類胡蘿卜素的含量在pH為7.9時總體呈下降趨勢，但相對于第1天和第7天，第3天時類胡蘿卜素的含量有所上升。

圖8 pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼類胡蘿卜素的影響Fig.8 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on Carotenoids content of Ulvapertusa

pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼類胡蘿卜素主體間效應的檢驗后發現，硫丹、pH對孔石莼類胡蘿卜素含量都具有顯著性影響(P<0.05)，并且在第1天、第3天及第7天均發揮了顯著作用(P<0.05)。反而硫丹與pH的交互作用在第1天、第3天和第7天均沒有發揮顯著性效應(P>0.05)。

2.3 硫丹脅迫及與pH耦合對孔石莼抗氧化酶活性的影響

2.3.1 硫丹對孔石莼抗氧化酶活性的影響 硫丹會誘導藻體細胞產生大量活性氧物質，導致細胞內活性氧的生成和清除平衡被破壞，從而造成氧化損傷。本實驗中主要考察了硫丹對孔石莼體內兩種抗氧化酶，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的影響。硫丹對孔石莼SOD總活性的影響如圖9所示。硫丹暴露第1天，50 μg/L處理組的SOD總活性最高，與對照組相比變化了129.36%，之后隨著硫丹濃度的增加，各濃度處理組SOD總活性逐漸降低并且下降幅度基本上一致。暴露第3天，SOD總活性不再存在促進作用，但在150 μg/L出現一個轉折點，之后的各濃度組SOD總活性的下降幅度增大。至第7天，各處理組一致表現出抑制作用，與對照組相比，差異性極顯著(P<0.01)，基本上呈現一種線性下降趨勢，且下降幅度達到最大。除了對照組SOD總活性上升之外，各處理組SOD總活性隨著暴露時間的延長均表現為抑制作用；至第7天，與對照組相比，各濃度處理組SOD總活性分別下降了13.80%、24.75%、35.96%、47.82%。

圖10為硫丹對SOD比活性的影響，由圖可知，孔石莼SOD比活性的變化趨勢于總活性完全不同。各濃度組SOD比活性在實驗周期內均受到不同程度的促進作用，并且在第7天時250 μg/L處理組受到的促進作用最明顯，達到一個極顯著的高峰值，與對照組相比升高了47.29%(P<0.01)。除了第3天各濃度組SOD比活性變化不明顯之外，第1天和第7天各處理組與對照組相比，均表現出極顯著的差異性(P<0.01)。第1天和第3天，隨著硫丹濃度的增加，SOD比活性有些許下降，變化幅度不明顯；至第七天，隨著濃度的升高SOD比活性出現先升高后下降的趨勢，與對照組相比，各濃度組分別上升了5.52%、13.38%、27.57%、17.88%，在350 μg/l處理組時開始呈現下降趨勢，但仍然高于其他濃度組的比活性。

圖9 硫丹對孔石莼SOD總活性的影響Fig.9 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on SOD total activityof Ulvapertusa

硫丹對孔石莼POD總活性的影響如圖11所示，暴露第1天和第3天，孔石莼POD總活性均是出現先升高后降低的趨勢，而在第7天為持續下降趨勢，且各處理組之間具有顯著性差異(P<0.05)。50 μg/L處理組在第1天POD總活性的達到最高峰值，與對照組相比上升了45.53%，說明低濃度的硫丹可以刺激POD酶的活性升高。而第3天則是在150 μg/L處理組出現輕微上升，之后活性立即下降，下降幅度很明顯。至第七天與對照組相比，各濃度組POD總活性分別下降了18.80%、31.61%、60.48%、70.04%。高濃度處理組250和350 μg/L的POD總活性具有顯著的劑量-時間效應關系，說明高濃度的硫丹脅迫下，會造成孔石莼的POD酶失活。

圖10 硫丹對孔石莼SOD比活性的影響Fig.10 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on SOD specific activity of Ulvapertusa

圖11 硫丹對孔石莼POD總活性的影響Fig.11 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on POD total activityof Ulvapertusa

圖12為硫丹對孔石莼POD比活性的影響。孔石莼POD比活性也呈現出低濃度促進作用，高濃度抑制作用。50 μg/L處理組在暴露第一天出現促進作用，與對照組相比，POD的比活性上升了33.24%。在硫丹暴露第2天，50和150 μg/L濃度組均表現出促進作用，與對照組相比分別升高了6.94%、20.23%。在暴露第7天，50和150 μg/L濃度組與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。隨著硫丹暴露時間的延長，150 μg/L濃度組的POD比活性在第三天先升高之后到第7天又下降，但仍然比第1天的比活性高。

圖12 硫丹對孔石莼POD比活性的影響Fig.12 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on POD specific activityof Ulvapertusa

2.3.2 硫丹與pH耦合對孔石莼抗氧化酶活性的影響 圖14 為pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼SOD比活性的影響。在環境pH和低pH條件下，孔石莼SOD比活性的變化趨勢表現較為一致，均為先升高再降低。環境pH條件下，暴露第7天時250 μg/L處理組出現SOD比活性的峰值，相對于對照組增加了27.58%。低pH條件下，暴露第1天時50 μg/L處理組的SOD比活性先上升隨后開始下降；在暴露第3天和第7天都是在150 μg/L處理組出現峰值，相對于對照組分別增加了18.35%和37.18%。在第7天低pH的各處理組除了L-0處理組之外，其他各濃度組與對照組均有極顯著性差異(P<0.01)。

從pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼SOD活性主體間效應分析來看，硫丹對孔石莼SOD比活性有作用，且在第1天、第3天和第7天均具有極顯著性影響(P<0.01)。pH僅在第3天和第7天對SOD比活性產生影響。硫丹與pH的交互作用僅在第七天發揮顯著作用(P<0.05)，第1天和第3天均無顯著影響(P>0.05)。

圖14為pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼POD比活性的影響。在環境pH和低pH條件下，孔石莼POD的比活性的變化趨勢一致表現為先升高再降低。且POD對硫丹脅迫的響應相較于SOD更加敏感。環境pH條件下，在暴露第1天時50 μg/L處理組POD比活性達到峰值，相對于對照組增加了33.22% ；150 μg/L處理組在暴露第3天時出現峰值，與對照組相比增加了20.12% ；至第7天各處理組POD比活性沒有明顯升高，高濃度時顯著降低。低pH條件下，暴露第1天、第3天和第7天均是50 μg/L處理組出現峰值，之后開始下降，相對于對照組分別增加了24.07%、33.74%和29.32% 。低pH條件下，除L-0、L-150 μg/L (7 d)、L-250 μg/L(1 d)3個處理組之外，其他處理組與對照組相比均有極顯著性差異(P<0.01)。

圖13 pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼SOD比活性的影響Fig.13 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on SOD activity of Ulvapertusa

圖14 pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼POD比活性的影響Fig.14 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on POD activity of Ulvapertusa

pH與不同濃度硫丹耦合對孔石莼POD活性主體間效應的檢驗后發現，硫丹對孔石莼POD比活性發揮作用，且在第1天、第3天和第7天均具有極顯著性差異(P<0.01)。pH在上述3個時間段對POD比活性均沒有顯著影響(P>0.05)。硫丹與pH的交互作用在第1天、第3天和第7天均發揮了作用，對POD比活性具有極顯著影響(P<0.01)。

3 討論

3.1 硫丹脅迫及與pH耦合對孔石莼生長的影響

植物的生長狀況會受諸多外界環境因素的制約與影響[13]，而生長的響應則是一系列生理生化參數受到脅迫的綜合表現[14]。本實驗中發現在高濃度硫丹脅迫下，孔石莼葉片出現嚴重白化現象，硫丹單獨脅迫時，孔石莼的相對生長率均隨硫丹濃度的升高而呈現先升高后下降的趨勢，相對生長率在硫丹濃度為50 μg/L 時達到最高，而暴露時間進一步延長后，硫丹對孔石莼的生長的促進作用逐漸減弱而抑制作用逐漸加深，這也與許多研究者發現低濃度有機污染物對藻類不但沒有毒害作用，反而有促進作用的結論一致。Stebbing[15]認為這種增益現象是生物的一種“毒物的興奮效應”，是自我保護的一種機制有機污染物促使藻類產生“興奮效應”的原因在于低濃度下，毒害和降解兩個過程同時存在,其中降解過程占主導地位，因而污染物對藻類傷害小，而在高濃度硫丹脅迫下，孔石莼的相對生長率遠遠低于對照組并且出現負增長。這可能是因為硫丹具有較高脂溶性，能滲透到藻體細胞壁并溶解于細胞膜中，破壞細胞的內含物組成，進而引起細胞萎縮甚至破裂，宏觀上表現為生長上受到抑制，藻體顏色出現發白。

pH是影響藻類生長繁殖重要的環境因子。其對藻類生長產生的影響取決于光合作用與呼吸作用間的碳收支平衡，本實驗中發現低pH環境時孔石莼的相對生長率高于 pH 為8.2的對照組；而光合色素含量相對于對照組有所下降。可能是在低 pH 下藻類細胞的滲透壓調節受到干擾，通過細胞的離子(如K+、Na+)流動失控，從而導致細胞功能的紊亂，細胞色素含量下降，光合作用速率降低的同時呼吸作用受到抑制影響更大。這與文獻中提到的海洋酸化導致海洋生物量的增加，但初級生產力可能并未有相應的增長相一致。

3.2 硫丹脅迫及與pH耦合對孔石莼光合色素的影響

光合作用色素是植物進行光合作用的物質基礎，也是間接反映進行光合作用生物的生物量指標，其含量變化能較好地反映生物各階段生長發育正常與否。目前的研究表明，藻類在遭受環境脅迫時，反映其光合強度的葉綠素、類胡蘿卜素等色素會發生變化[16]，這可能與色素前體的周轉和轉化有關。硫丹單獨脅迫時，50 μg/L處理組能夠刺激孔石莼體內光合色素含量增加，而高濃度硫丹則會降低光合色素含量，且葉綠素a受到的抑制作用尤其顯著，藻體的光合作用也受到了明顯的抑制作用；而低 pH 與硫丹耦合脅迫的各處理組相對于僅受硫丹脅迫的各處理組光合色素的含量下降幅度更大，表明 pH 加重了硫丹對孔石莼的毒性效應，兩者關系表現為協同作用。其可能的原因是硫丹的理化性質受環境因子pH的影響，在低 pH 環境下硫丹在水中的半衰期會增加，降解的更緩慢。因此在低 pH 硫丹處理組中光合色素的含量整體比環境pH條件下各處理組色素含量低。Alberte[17]認為逆境脅迫下葉綠素含量降低的主要原因是葉綠體片層中捕光 Chla/b- Pro 復合體合成受到抑制。在低濃度硫丹單獨脅迫時，孔石莼中3種色素含量都會增加，這可能是光合色素合成系統對硫丹毒害的一種應激反應，可以作為一種有效保護機制抵御硫丹對藻體的毒害，光合色素含量的增加使藻體能夠吸收更多的光能進行光合作用，從而為藻體生長代謝提供能量；同時，類胡蘿卜素可以作為抗氧化劑清除自由基和單線態氧，防止膜脂的過氧化，維持膜結構的穩定。

光合器官是植物細胞內超氧自由基等的主要來源之一，而光合色素及與之結合的類囊體膜均具有不飽和多烯結構，極易受 ROS 的攻擊。本實驗中， 350 μg/L的硫丹單獨脅迫下孔石莼葉綠素a和類胡蘿卜素的含量均有較為明顯的下降，可能是由于孔石莼受硫丹脅迫后，細胞內活性氧的產生和清除間的平衡被破壞，導致活性氧積累，損傷了細胞膜的結構和功能。唐學璽等的研究表明，久效磷脅迫下扁藻葉綠素a的降解與活性氧的損傷有關[18]。

3.3 硫丹脅迫及與pH耦合對孔石莼抗氧化酶活性的影響

藻類抗氧化酶保護系統主要包括SOD、CAT和POD等，超氧化物歧化酶(SOD)是細胞內 ROS 清除系統的主要成分，是需氧生物長期進化過程中形成的一套復雜的抗氧化保護系統的成分之一，與 CAT、POD 等酶抗性系統一起協同防御活性氧或其他過氧自由基對細胞膜系統的傷害。Wang等通過實驗發現壬基酚暴露處理 12 天的銅綠微囊藻的GST和SOD 活力均有升高，但是 GST 活力變化比 SOD 活力變化更明顯，認為 GST 在消除毒物毒性上貢獻比 SOD 要大[19]。本實驗結果顯示，硫丹單獨脅迫時孔石莼體內SOD和POD酶活性都是隨著丹濃度的遞增呈現先升高后下降的趨勢，在50 μg/L硫丹脅迫下，SOD的總活性升高；50和150 μg/L處理組的POD總活性均有不同程度的上升，并且SOD比活性變化的更顯著。在350 μg/L硫丹脅迫下，SOD和POD的總活性明顯下降，但POD在高濃度脅迫環境下活性比SOD下降的更低，說明POD對硫丹脅迫更加敏感。

岳文杰等研究顯示，高濃度的氯氰菊酯脅迫后龍須菜的可溶性蛋白含量受到抑制，本實驗中，孔石莼在高濃度硫丹脅迫下生長受到嚴重脅迫，可溶性蛋白含量也表現出顯著降低， SOD和POD活性是相對的增加[20]。Prasad等研究結果顯示，在硫丹刺激下，絲狀藍菌的抗氧化酶SOD、CAT、POD的比活性都顯著增強[21]。硫丹濃度為250 μg/L時，孔石莼SOD的比活性出現上升趨勢，而150 μg/L硫丹處理組的POD活性上升幅度更加明顯。

本實驗發現低濃度硫丹能使藻體產生誘導反應，增加抗氧化酶的活性，以抵抗氧化脅迫。而高濃度硫丹脅迫下孔石莼體內的抗氧化系統發生紊亂，抗氧化酶活性降低，使得藻體對硫丹脅迫的抗性機制喪失。這些在微藻中也有相同報道，沈忱等用苯并芘脅迫三種海洋微藻，發現隨著脅迫時間的延長 BaP 的誘導作用逐漸消失，表現出抗氧化酶活力先升高后降低的總趨勢[22]。這種現象在其他植物中也有廣泛的報道。實驗結果表明孔石莼對硫丹的脅迫具有一定的耐受能力，輕度脅迫下，孔石莼的抗氧化防御系統產生適應性的誘導反應；而當外界脅迫加重時，會對抗氧化系統產生抑制效應。

當硫丹和pH共同脅迫時，低 pH 硫丹處理組的抗氧化酶的活性對硫丹的敏感程度與環境 pH 處理組不同。實驗結果顯示環境 pH 處理組SOD 的比活性在250 μg/L時上升幅度最大，而低 pH 處理組在150 μg/L時已經達到最大峰值，說明低 pH 條件下SOD 的比活性對硫丹更加敏感。POD 的比活性在環境 pH 處理組在硫丹暴露第1天達到頂峰，低 pH 處理組則在硫丹暴露第3天達到最大值，說明相對于環境 pH 條件，POD 對硫丹脅迫的敏感性在低 pH 條件下減小。

4 結論

(1) 硫丹對孔石莼單獨脅迫時，低濃度的硫丹對孔石莼的生長、光合色素以及抗氧化酶系統都表現出“毒物興奮效應”，硫丹濃度為50 μg/L時促進效應最為顯著，這是藻類的一種自我保護機制。具體表現為相對生長率升高、光合色素含量增加以及抗氧化酶活性的上升；高濃度硫丹脅迫下，由于活性氧的過量累積，孔石莼的生長代謝過程均受到了不同程度的損害。孔石莼的生長受到抑制，相對生長率下降甚至出現負增長，藻體顏色發白，光合色素含量出現明顯下降，抗氧化酶活性受到顯著抑制。

(2) 硫丹與環境因子pH耦合實驗中，低pH條件會促進孔石莼的生長，但降低了孔石莼光合色素的含量。在低pH條件下，硫丹對孔石莼的刺激作用更加顯著，表現為低濃度更加促進，高濃度時抑制作用加劇。低 pH 條件下各處理組抗氧化酶對硫丹的敏感程度與環境 pH 處理組不同，SOD對硫丹更為敏感而POD對硫丹的敏感性則有所下降。硫丹與pH的交互作用在孔石莼不同生理過程中發揮的效應程度不同，考慮到pH對硫丹的一些理化性質也會產生影響，因此在暴露的各階段，孔石莼對脅迫的響應也有所不同。

另外針對本實驗中硫丹對大型海藻在個體和生理生化上的生態毒理影響，硫丹分子層面的作用機理和調控方式將是本文下一步的研究內容。