復方健腎顆粒的質量控制研究

陳平 米完完 應園園 王航利 張夢迪 黃繩武

[摘要] 目的 建立復方健腎顆粒的質量標準，為其質量控制提供依據。 方法 根據2010版藥典對于顆粒劑的質量要求，主要從性狀、薄層鑒別、檢查、含量測定等方面對復發健腎顆粒進行質量評價，其中以黃芪甲苷、腺苷對照品和熟地、黃精對照藥材進行制劑的鑒別研究;建立HPLC法，測定制劑中黃芪甲苷和腺苷的含量。 結果 黃芪、熟地、黃精、蟬花的薄層斑點清晰，圓整，陰性制劑無干擾。粒度、水分、溶化性、裝量差異符合要求。定量分析黃芪甲苷在2.70～9.45 μg范圍內的回歸方程為：log（Y）=1.419log（X）+4.0412，R2=0.9993，平均回收率100.45%，RSD為2.81%。復方健腎顆粒中黃芪甲苷含量限度為0.0356%，定量分析腺苷在濃度0.628～7.536 μg/mL范圍內的回歸方程為：Y=74.354x+14.256，R2=0.9993，平均回收率97.71%，RSD為1.95%。復方健腎顆粒中腺苷含量限度為0.005%。結論 方法穩定可行，重復性好，操作簡單、方便，適用于復方健腎顆粒的質量控制。

[關鍵詞] 復方健腎顆粒;質量評價;薄層色譜;黃芪甲苷;腺苷;含量測定

[中圖分類號] R286? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）36-0037-07

Study on the quality control of compound Jianshen granules

CHEN Ping MI Wanwan YING Yuanyuan WANG Hangli ZHANG Mengdi HUANG Shengwu

Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? ?311400， China

[Abstract] Objective To establish the quality standard of compound Jianshen granules and provide the basis for its quality control. Methods Inaccordance with the quality requirements of granules in Pharmacopoeia 2010， the quality of compound Jianshen granules was evaluated in terms of properties， thin-layer identification， inspection and content determination， among which the identification study was performed using Astragaloside， Adenosine as control herbs and Radix rehmanniae， Rhizomapolygonatumas control materialsrespectively.And High Performance Liquid Chromatography（HPLC） method was established for the determination of Astragaloside and Adenosine in preparations. Results The thin-layer chromatography（TLC） spots of Astragalus， Radix rehmanniae， Rhizomapolygonatum and Cordycepssobolifera were clear， round and normal， and the negative preparation had no interference. The differences of granules size， water content， solubility and loading amount met the requirements. The regression equation of Astragaloside in the range of 2.70～9.45 μg was log（Y）=1.419log（X）+4.0412， R2=0.9993， the average recovery rate was 100.45%， relative standard deviation（RSD） was 2.81%. The content limit of Astragaloside in compound Jianshen granules was 0.0356%. The regression equation of Adenosine in the range of 0.628-7.536 μg/mL was Y=74.354x+14.256， R2=0.9993， the average recovery rate was 97.71%， RSD was 1.95%. The content limit of Adenosine in compound Jianshen granules was 0.005%. Conclusion This method is stable， feasible， reproducible， easy to operate， facility and suitable for the quality control of compound Jianshen granules.

[Key words] Compound Jianshen granules; Quality evaluation; Thin-layer chromatography; Astragaloside; Adenosine; Content determination

隨著人們經濟生活水平的提高，DM的患病率逐年增高，流行病學研究表明在非傳染性疾病中DM發病率僅次于腫瘤及心血管病變，已經成為威脅人們生命健康的重要公共衛生問題之一[1]。預計到2030年全世界范圍內2型糖尿病的患病率將達到500萬[2-3]，其中將近1/4～1/3發展為DN[4-5]，在DN發病后，約20%將發展成終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）[6-7]。DN已逐漸取代DM急性并發癥成為嚴重影響患者生活生存質量及威脅患者生命的主要因素，是導致ESRD的最重要病因[8]。

復方健腎方是名中醫臨床經驗方，具有降低血糖、保護腎臟的功能。組方為：熟地18 g、黃芪12 g、黃精12 g、蟬花6 g。前期工作已建立復方健腎顆粒提取工藝方法學以及提取工藝研究，并根據現代制劑的要求制備成顆粒劑。后期在此臨床經驗方的基礎上也進行了小活絡緩釋微丸等制劑的研究，為后期實驗提供堅實的理論基礎。根據相關參考文獻[9-12]，黃芪和蟬花的鑒別以黃芪甲苷和腺苷標準品作為對照，熟地和黃精以其對照藥材作為對照。黃芪中的皂苷類、多糖類是黃芪的主要有效成分，黃芪甲苷為黃芪總皂苷的主要活性指標成分之一[13-14]。熟地和黃精均為多糖類成分[15-16]，蟬花主要為腺苷和多糖成分[17]，其中腺苷為蟬花的主要有效成分，故本實驗以黃芪甲苷和腺苷為控制指標對復方健腎顆粒進行質量監控。

1 材料與儀器

1.1 實驗藥品與試劑

熟地黃對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121196-201105）;制黃精對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121553-201101）;腺苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110879-200202）;硫酸（浙江中星化工試劑有限公司，批號：20140307）;黃芪甲苷對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：11092002）;正丁醇（杭州高晶精細化工有限公司，批號：20100909）;甲醇（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20150620）;乙醇（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20150726）;甲酸（永華化學科技有限公司，批號：20150530）;氨水（浙江中星化工試劑有限公司，批號：20101220）;三氯甲烷（西隴化工股份有限公司，批號：141016）;石油醚（60℃～90℃）（永華化學科技有限公司，批號：141016）;乙酸乙酯（永華化學科技有限公司，批號：20140917）;異丙醇（杭州雙林化工試劑廠，批號：20131219）;乙腈（天津市四友精細化學品有限公司，批號：100313）;磷酸二氫鉀（湖州湖試化學試劑有限公司，批號：100301）。

1.2 實驗儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司）;Shimadzu高效液相色譜儀（日本島津公司）;GoodSee-Ⅱ暗箱式薄層色譜攝影儀（上海科哲生化科技有限公司）;KQ5200DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;JA203H電子分析天平（常州市幸運電子設備有限公司）;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）;HH-4數顯恒溫水浴鍋（常州市幸運電子設備有限公司）。

2 方法與結果

2.1 性狀

本品外觀大小均勻，顏色呈褐色，味：甜，顆粒流動性好。

2.2 鑒別

2.2.1 黃芪的薄層鑒別

2.2.1.1 對照品溶液的制備? 使用甲醇溶液將黃芪甲苷對照品配制成1 mg/mL的對照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液的制備? 取復方健腎顆粒5 g研成細粉，用50 mL甲醇超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干。殘渣加水10 mL溶解，使用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次需要水飽和正丁醇20 mL，合并正丁醇液，用氨試液再次振搖提取2次，每次需要氨試液20 mL，棄去氨液，收集正丁醇液于蒸發皿中用水浴鍋蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.1.3 陰性對照溶液的制備? 取除黃芪外的其余藥材，按照處方工藝制成不含黃芪的顆粒，同供試品溶液制備方法操作，制得黃芪陰性樣品溶液。

2.2.1.4 薄層展開? 分別吸取對照品溶液、供試品溶液和缺黃芪的陰性樣品溶液，在同一硅膠G薄層板上點樣，選擇展開劑為三氯甲烷-甲醇-水的下層溶液，其中三種溶劑的比例是（13：7：2），將硅膠板放在展開缸中進行展開，展開完成后，取出硅膠板，通風櫥中將展開劑風干，在硅膠板上適量噴灑10%硫酸乙醇溶液作為顯色劑，加熱直至斑點顯色清晰，在紫外光燈365 nm下觀察薄層板顯色現象，結果斑點清晰，圓整，陰性樣品無干擾。故可用于復方健腎顆粒中黃芪的薄層鑒別，見封三圖2。

2.2.2? 熟地的薄層鑒別

2.2.2.1 對照藥材溶液的制備? 稱取熟地對照藥材粉末1 g于錐形瓶中，量取50 mL甲醇作為溶劑超聲提取30 min，過濾，濾液置于蒸發皿中于水浴鍋上蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取，合并正丁醇液，將正丁醇液置蒸發皿中于水浴鍋上蒸干，殘渣備用。移液槍吸取2 mL甲醇將殘渣溶解，作為對照藥材溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備? 取復方健腎顆粒粉末5 g，按照對照藥材溶液相同的處理方法制得供試品溶液。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備? 按照處方要求稱取除熟地外的其余藥材，按照復方健腎顆粒的制備工藝制成不含熟地的樣品，同對照藥材溶液制備方法操作，得到缺熟地的陰性樣品溶液，備用。

2.2.2.4 薄層展開? 分別吸取上述制備的對照藥材溶液、供試品溶液和缺熟地的陰性樣品溶液，在同一硅膠G薄層板上相應的位置上點樣，選擇展開劑為環己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（4：10：1：5：2）的下層溶液，展開，將硅膠板從展開劑中取出，通風櫥中晾干至硅膠板表面無明顯的溶劑殘留，置紫外光燈365 nm下觀察現象，結果陰性樣品無干擾。故可用于復方健腎顆粒中熟地的薄層鑒別，結果見封三圖3。

2.2.3 黃精的薄層鑒別

2.2.3.1 黃精對照藥材溶液的配制? 取黃精對照藥材粉末1 g置于錐形瓶中，使用70%乙醇20 mL，加熱回流提取1 h，抽濾，濾液蒸干，用10 mL水將殘渣溶解，加正丁醇振搖萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，將正丁醇液倒入蒸發皿中于水浴鍋上蒸干，殘渣備用，用移液槍吸取2 mL甲醇將殘渣溶解，作為對照藥材溶液。

2.2.3.2 供試品溶液的制備? 取復方健腎顆粒粉末5 g，按照對照藥材溶液相同處理方法制得供試品溶液。

2.2.3.3陰性樣品溶液的制備? 按照已確定的處方取除黃精外的其余藥材，按照復方健腎顆粒的制備工藝制成不含黃精的顆粒，同供試品溶液相同的處理方法，制備缺黃精的陰性樣品溶液。

2.2.3.4 薄層展開? 吸取上述對照藥材溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，在同一硅膠G薄層板上點樣，將石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-甲酸=（5：2：0.1）的溶液做為展開劑，展開，取出，晾干，噴以適量5%香草醛硫酸溶液作為顯色劑，加熱至斑點顯色清晰，日光燈下觀察薄層顯色現象，結果陰性樣品無干擾，故可用于復方健腎顆粒中黃精的薄層鑒別，結果見封三圖4。

2.2.4 蟬花的薄層鑒別

2.2.4.1 對照品溶液的制備? 取腺苷對照品，加甲醇制成2 mg/mL腺苷的溶液，作為對照品溶液。

2.2.4.2 供試品溶液的制備? 取復方健腎顆粒5 g置于錐形瓶中，將其用50 mL甲醇作為溶劑超聲提取30 min，將提取液過濾，濾液蒸干，殘渣用10 ml水進行溶解，使用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次需要水飽和正丁醇液20 mL，收集正丁醇液，于蒸發皿中在水浴鍋中蒸干，殘渣備用。移液槍吸取甲醇2 mL將殘渣溶解，作為供試品溶液。

2.2.4.3 陰性樣品溶液的制備? 取除蟬花外的其余藥材，按照復方健腎顆粒的制備工藝制成不含蟬花的顆粒，按照供試品溶液同樣的處理方法，制備蟬花陰性樣品溶液。

2.2.4.4? 薄層展開? 吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各5 μL，在同一硅膠GF254薄層板上點樣，以氯仿-醋酸乙酯-異丙醇-水-濃氨水（5：2：6：0.6：0.13）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈254 nm下檢視，結果陰性樣品在同樣的位置無斑點，故可用于復方健腎顆粒中蟬花的薄層鑒別。結果見封三圖5。

2.3 檢查

2.3.1粒度? 分別取3批樣品各3袋，按《中國藥典》2010年版一部附錄XIB第二法雙篩分法測定，不能通過一號篩與能通過五號篩的顆粒和粉末總和均小于15%，結果符合規定。測定結果見表1。

表1? ?3批樣品粒度檢查結果（n=3）

2.3.2 水分? 分別取3批樣品各3袋，按《中國藥典》2010年版一部附錄IXH水分測定法第一法（烘干法）檢查，取供試品2～5 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，精密稱定，打開瓶蓋在100℃～105℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻，稱重，至連續兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據減失的重量，計算供試品中的含水量（%）。規定水分不得超過6.0%。測定結果見表2。

2.3.3 溶化性? 分別取3批樣品各3袋，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，顆粒劑應全部融化，允許有輕微渾濁。符合《中國藥典》2010年版一部的要求。結果見表3。

2.3.4 裝量差異? 分別取3批樣品各3袋，按《中國藥典》2010年版一部附錄顆粒劑項下檢查，分別稱定每袋內容物的重量，每袋裝量與標示裝量相比較，超出裝量差異限度的不得多于2袋，并不得有1袋超出限度1倍。結果見表4。

表4? ?3批樣品裝量差異結果（n=3）

注：結果表明3批樣品裝量差異均小于士5%，符合藥典規定

2.4 含量測定

2.4.1 黃芪甲苷含量測定

2.4.1.1 對照品溶液的制備? 將黃芪甲苷用甲醇溶液配制成0.54 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液。

2.4.1.2? 供試品溶液的制備? 取自制復方健腎顆粒10 g，研缽研磨成細粉，混合均勻。稱取細粉5 g，置于錐形瓶中，選擇100 mL甲醇作為提取溶劑，先進行浸泡提取，提取時間2 h，再加熱回流提取，提取時間1 h。將提取液濾過，濾液蒸干，將蒸干后的物質用10 mL水溶解，再依次用水飽和正丁醇和氨試液洗滌，保留的正丁醇液于蒸發皿中用水浴蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，放冷后將樣品過D101大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，長12 cm），分別用水、40%乙醇、70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液。將洗脫液置于蒸發皿中用水浴鍋蒸干，殘渣備用。用移液槍量取少量甲醇將殘渣溶解后轉移至5 mL容量瓶中，使用甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液[18-20]。

2.4.1.3 標準曲線的繪制? 分別精密移取黃芪甲苷對照品溶液，進樣量范圍設置為：5～17.5 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以黃芪甲苷進樣量（μg）的對數值為橫坐標（X），峰面積的對數值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程為log（Y）=1.419log（X）+4.0412，R2=0.9993，表明其在2.70～9.45 μg內線性關系良好。

2.4.1.4? 精密度試驗? 將2.4.1.1 下配制的黃芪甲苷對照品溶液精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，計算峰面積，連續進樣6針，RSD為2.82%，表明本儀器的精密度良好。

2.4.1.5 重復性試驗? 按照復方健腎顆粒的處方工藝制備成6批顆粒，按照供試品溶液相同的方法進行處理，制備樣品溶液。設置進樣的樣品量為10 μL，每份樣品均進樣1次。注入液相色譜儀，計算色譜峰面積，RSD為1.79%，表明本實驗使用的方法制備的黃芪甲苷重復性良好。

2.4.1.6 穩定性試驗? 精密吸取2.4.1.2項制備的黃芪甲苷供試品溶液20 μL，在24 h內不同的時間點將對照品溶液注入高效液相色譜儀，記錄各時間點的峰面積，RSD為2.21%，表明復方健腎顆粒溶液中黃芪甲苷在24 h內穩定。

2.4.1.7 加樣回收率試驗? 精密吸取2.4.1.2項制備的供試品溶液，取6份于6個容量瓶中，分別加入黃芪甲苷對照品溶液0.27 mg，搖勻，用甲醇溶液定容至刻度，將樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾，6份溶液各均取過濾后的樣品7.5 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，結果可知黃芪甲苷的平均加樣回收率為100.45%， RSD值為2.81%，表明該方法穩定可行。結果見表5。

2.4.1.8 復方健腎顆粒中黃芪甲苷含量測定? 取自制的復方健腎顆粒3批（20151116～20151118），均按照供試品溶液的操作方法處理復方健腎顆粒，精密吸取適量樣品溶液（在標準曲線范圍內的量）注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據標準曲線計算黃芪甲苷含量為0.0445%。考慮到各種外界因素會影響含量，含量限度規定是均值的80%，故本實驗暫定復方健腎顆粒中黃芪甲苷含量限度為0.0356%。結果見圖1、圖2、表6。

2.4.2 腺苷含量測定? 本課題采用HPLC測定蟬花藥材及復方健腎顆粒中腺苷的含量，色譜條件如下：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（5 μm，150×4.6 mm）;流動相：0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液;甲醇=90：10;檢測波長：260 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進樣量：20 μL。

2.4.2.1 對照品溶液的配制? 精密稱取腺苷標準品1.57 mg至25 mL容量瓶中，用10%甲醇溶解，定容，搖勻，制備成62.8 μg/mL的對照品溶液作為母液。

2.4.2.2 供試品溶液的配制? 精密稱取復方健腎顆粒1 g于錐形瓶中，加入10%甲醇20 mL，稱重，超聲處理30 min，用10%甲醇補足重量，搖勻，過濾，用0.452 μm微孔濾膜過濾，即為樣品溶液[21-22]。

2.4.2.3 標準曲線繪制? 分別從母液中移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL對照品溶液于10 mL容量瓶中，使用10%甲醇定容，搖勻，取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以腺苷峰面積A對濃度C（μg/mL）進行線性回歸。回歸方程為：Y=74.354x+14.256，R2=0.9993，表明腺苷在0.628～7.536 μg/mL峰面積與濃度線性關系良好。

2.4.2.4精密度? ? 取2.4.2.1項下對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，高效液相色譜儀設置進樣6針，記錄峰面積，RSD為2.18%，表明精密度良好。

2.4.2.5 重復性? 精密稱取復方健腎顆粒1 g，平行6份，加入10%甲醇20 mL，稱重，超聲處理30 min，用10%甲醇補足重量，搖勻，過濾，取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，RSD為2.14%，表明重復性良好。

2.4.2.6 穩定性? 取2.4.2.5項下溶液同法操作在第0、1、2、3、4、5、6 h時間內測定供試品溶液的峰面積，RSD為2.63%，表明腺苷在6 h內比較穩定。

2.4.2.7 加樣回收率試驗? 取已知含量的復方健腎顆粒溶液9份至5 mL容量瓶中，分別加入供試品溶液的80%、100%、120%的標準品溶液，滴管吸取10%定容至刻度，搖勻，設置進樣量為20 μL，將樣品注入液相色譜儀，計算平均回收率為97.71%，RSD為1.95%。結果見表7，可知加樣回收率符合要求。

2.4.2.8 復方健腎顆粒中腺苷含量測定? 取復方健腎顆粒1 g，平行3批，精密稱定，加入10%甲醇20 mL，稱重，超聲提取30 min，用10%甲醇補足重量，搖勻，過濾，0.45 μm微孔濾膜過濾，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據標準曲線計算腺苷含量為0.00627%。考慮到各種外界因素作用會導致含量變化，含量限度規定是均值的80%，故本實驗暫定復方健腎顆粒中腺苷含量限度為0.005%。結果見圖3、圖4、表8。

3討論

薄層點樣時，需要用鉛筆劃定供試品溶液、對照藥材或對照品溶液，陰性對照溶液的點樣位置，在劃定過程中不要太用力，防止破壞硅膠，影響點樣效果。薄層色譜展開時，需要將展開劑于展開缸預飽和20～30 min，點樣時應使斑點盡可能小，并且每次點樣盡可能在同一位置，需要做到多次少量點樣的原則，也可使用外界工具如吹風機或者洗耳球使樣品溶液在短時間內揮干，薄層板置于展開缸中飽和30 min后再上行展開。在噴灑顯色劑的過程中，顯色劑的量太少，則斑點顯色不清楚。若顯色劑的量過多，硅膠板容易出現碳化現象，故顯色劑需適量。

在黃芪甲苷的供試品處理過程中，多次需要使用水飽和正丁醇進行振搖提取，需要注意振搖不要太劇烈，防止發生乳化現象。

在黃芪的薄層鑒別時，點樣量為10～20 μL時，斑點出現偏移，后改為5 μL，薄層展開效果較好，符合要求。

在蟬花薄層鑒別時，曾用含4%磷酸氫二鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑自制硅膠GF254薄層板，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（12：6：3：3：1） 為展開劑，由于展開效果不理想，后改為市售GF254板，分別以展開系統1：環己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（4：10：1：5：2）的下層液和展開系統2：正己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（2：11：1：5：2）的下層液進行展開，根據展開效果最終確定展開系統1為展開劑。

對于復方健腎顆粒的質量控制研究中，使用HPLC-ELSD對黃芪甲苷進行定量測定，方法精密度高、準確度好，能夠對黃芪甲苷的含量準確測定;同時使用了薄層色譜法鑒定黃芪甲苷，方法可行。使用HPLC-UV對蟬花腺苷進行定量測定，方法學重復性好，加樣回收率符合要求，能夠對腺苷含量進行高效、準確測定;使用薄層色譜法鑒定腺苷成分，斑點清晰圓整，可用于腺苷的定性測定。本實驗同時使用薄層色譜法和高效液相色譜法同時對黃芪甲苷以及腺苷進行測定，質量評價方法準確且完善。

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（收稿日期：2019-10-11）