滋腎通竅飲對實驗性糖尿病大鼠血清生長激素、視網膜毛細血管基底膜厚度的影晌

鐘瑞英，俞曉藝，田 妮

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是嚴重威脅人類健康和生命的常見疾病，發病率逐年增長，患病10年以上2型DM患者大多數都會發展成糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR)）[1]。 DR 是 DM 最常見的嚴重并發癥之一，是反映機體代謝、內分泌及血液損害的典型微血管病變[2]，而傳統中醫藥在治療DR上已證實具有確切的療效[3-6]。中藥是否能通過對DM患者神經內分泌及免疫系統的調節，而發揮其防治DR特有的功效？從臨床應用中藥滋腎通竅飲治療DR，發現治療DR非增殖前期病變有良好的療效[7]。本研究采用傳統的DM模型：即鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導的SD大鼠模型，觀察滋腎通竅飲對DM大鼠的血清GH、視網膜毛細血管基底膜厚度的影響，從而探索滋腎通竅飲對糖尿病視網膜病變的作用機理，為中醫藥防治糖尿病性視網膜病變的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康成年SD大鼠50只 (約2月齡)，體質量（350±20）g，雌雄各半，廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。檢查屈光間質清，瞳孔等大等圓，對光反射好。所有動物全程分籠飼養在達標動物房內(由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供)，全程顆粒飼料喂飼，不限飲水、進食，自然晝夜光線照明。室內通風良好，氨濃度小于2 QPPM，室溫保持 18～22°C，相對濕度為40%～70%。

1.2 藥品及試劑

滋腎通竅飲 處方組成：山萸肉20g、枸杞子15g、桑椹子 15 g、菟絲子 15 g、女貞子 15 g、石斛 12 g、黃芪 15g、太子參 20g、茯苓 15g、旱蓮草 10g、澤蘭 10g、田七 10g、丹參 10g、柴胡 12g、石菖蒲 15g、香附 12g、葛根20 g、升麻10g。由廣州中醫藥大學第一附屬醫院制劑室將中藥按比例每劑用300 ml清水浸泡30 min后，放入自動煎藥機內，在壓力1.5㎏、溫度100°C狀態下煎煮40 min，濃縮過濾，將藥液裝入真空袋內，每劑濃縮成40 ml，其濃度為5.9 g/ml。

導升明膠囊（奧地利依比威大公司，國藥準字：H20070370）；鏈脲佐菌素(STZ美國 Sigma公司，批號：HZB0894)。

1.3 主要儀器

Accutrend alpha血糖儀（美國強生公司）。YB-6型生物組織包埋機 （湖北亞光醫用電子技術研究所）。ZT-12H生物組織自動脫水機（湖北亞光醫用電子技術研究所）。LEICA RM2025石蠟切片機（德國Leitz公司）。BH-2，BX-50生物顯微鏡（Olympus公司）。Cryostat172O恒溫箱切片機 （德國Leitz公司）。超微切片機（德國Lei tz公司）。透射電鏡H-800（日本日立公司）。

1.4 造模方法

參考預實驗與文獻方法[8]制作一個實驗誘發的2型糖尿病大鼠模型，其發病過程及特征與部分患者的臨床過程及代謝特征類似。將40只制模前大鼠禁食10h，自由飲水。將STZ溶于pH=4.5的0.1mmol/L枸椽酸鈉緩沖液，配成1%STZ溶液，經紫外線消毒滅菌后，按60 mg/kg一次性大鼠腹腔注射。72 h后用尿糖試紙測尿糖，取鼠尾血測血糖，隨機血糖濃度≥16.65 mmol/L，尿糖在++～+++者即為DM大鼠成功模型。血糖低于＜16.65 mmol/L的大鼠于禁食10 h后再次注射上述相同劑量的STZ累加成模，同法測血糖篩選出DM大鼠。造模成功后開始計算病程。此后每月測1次血糖，每周稱體質量。所有大鼠在灌胃期間自由飲水進食，根據體重變化調整藥物用量。

1.5 分組與給藥方法

將造模成功的DM大鼠按隨機數字法分為5組：正常組：灌胃蒸餾水2 ml，1次/d。模型組：灌胃蒸餾水2 ml，1次/d。滋腎通竅飲低劑量組：灌胃相當成人劑量5倍滋腎通竅飲制劑(23.6 g/kg)，1次/d。滋腎通竅飲高劑量組：灌胃相當成人劑量10倍滋腎通竅飲制劑，(47.2 g/kg)，1次/d。導升明組：灌胃相當成人5倍制劑(0.107 g/kg)，1次/d。持續3個月。

1.6 血清GH測定

取有蓋的玻璃器皿放入適量的乙醚，待大鼠麻醉后，頸動脈插管取血，保存于-20℃儲存待測。用低溫大容量離心機分離血清，于37℃水浴孵育3 h,經三次非特異性洗脫,用放射免疫計數器測定血清GH。

1.7 電鏡樣品的制備及基底膜厚度測定

參考預實驗與文獻方法[9],過量麻醉處死大鼠，摘除眼球，自角膜緣后0.5 mm處剪開眼球,去除眼前節和玻璃體，取大鼠右眼球視網膜組織切成面積為1.5 mm×3 mm的小塊，2.5%戊二醛、1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，樹脂包埋，LKB超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾及枸椽酸鉛雙重染色，取每份視網膜透射電鏡下觀察。

1.8 統計方法

2 結果

2.1 實驗前各組大鼠體質量、血糖、生長激素值

40只SD大鼠共有37只成模。1只于造模后1 d死亡，2只于造模后第2 d死亡。與正常組比較，STZ誘導的模型組大鼠的血糖和血清GH的含量顯著增加，差異具有統計意義（P＜0.05），提示STZ誘導的DM大鼠造模成功；造模成功后各實驗組DM大鼠體質量、血糖、血清GH值比較均未見明顯統計學差異(P＞0.05)。 （表 1）

表1 實驗前各組大鼠體質量、血糖、生長激素值比較

表1 實驗前各組大鼠體質量、血糖、生長激素值比較

注：*與正常組比較，P＜0.05

?

2.2 滋腎通竅飲對DM大鼠體質量、血糖和血清生長激素的影響

與模型組比較，滋腎通竅飲高和低劑量組對DM大鼠的體質量具有升高的趨勢，但滋腎通竅飲高、低劑量與模型組組間體質量值相比均未見明顯統計學差異(P＞0.05)。此外，滋腎通竅飲高和低劑量組對DM大鼠的血糖具有降低的趨勢，但滋腎通竅飲高、低劑量與模型組組間血糖值相比均未見明顯統計學差異(P＞0.05)。滋腎通竅飲高和低劑量組治療后DM大鼠的血清GH分別與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示滋腎通竅飲具有抑制STZ誘導DM大鼠的血清GH升高作用。導升明陽性對照組治療后血糖和血清GH與模型組比較，差異有統計意義 (P＜0.05)，提示導升明陽性對照組可抑制STZ誘導的血糖和GH升高作用。（表2）

表2 滋腎通竅飲對DM大鼠體重、血糖和血清生長激素的影響（s）

表2 滋腎通竅飲對DM大鼠體重、血糖和血清生長激素的影響（s）

注：* 與正常組比較，P＜0.05；# 與模型組比較，P＜0.05

?

2.3 滋腎通竅飲對視網膜毛細血管基底膜厚度變化情況

正常組為連續的電子密度均勻的膜性結構，環繞內皮細胞及周細胞，基底膜清楚，連續完整。模型組電子密度不均勻，節段性結節樣增厚。導升明組電子密度不均勻，連續彎曲增厚。滋腎通竅飲低劑量組電子密度不均勻，結構模糊，連續彎曲增厚。滋腎通竅飲高劑量組電子密度較均勻，結構清晰，增厚不明顯（圖1）。以上結果提示滋腎通竅飲可顯著改善視網膜毛細血管基底膜厚度的作用。

3 討論

非增生性糖尿病視網膜病變是糖尿病性視網膜病變的早期階段，多數DM者特別是合并有DR的患者其血清GH水平一般較高[10-11]。血清GH能促進蛋白質的合成，能增強葡萄糖甙轉移酶和半乳糖苷轉移酶的活性，因而促進糖蛋白的合成，這些糖蛋白可沉積在毛細血管壁基底膜上，使基底膜不斷增厚，進而促使糖尿病微血管病變的發生與發展[12]。研究證實，STZ誘導的DM大鼠的視網膜病變主要表現為外膜細胞損失，血-視網膜屏障損壞，毛細血管基底膜增厚，電子密度不均勻[9,13]。成模大鼠平均血糖值(21.47±1.99)mmol/L，DM 大鼠血清 GH 值（4.02±0.48）ug/L，成模大鼠與正常組大鼠的血糖值、血清GH值比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。模型組DM大鼠視網膜毛細血管基底膜電子密度不均勻，節段性結節樣增厚（圖1）。本研究也證實了糖尿病大鼠的血清GH水平比正常大鼠增高；毛細血管基底膜增厚，電子密度不均勻。治療后，導升明組、滋腎通竅飲低劑量組及滋腎通竅飲高劑量組血清GH值比模型組低，而且中藥高劑量組血清GH值為最低 （表2）。分別與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示滋腎通竅飲具有改善STZ誘導DM大鼠的血清GH升高的作用。滋腎通竅飲低劑量組電子密度不均勻、結構稍模糊、連續彎曲增厚；滋腎通竅飲高劑量組電子密度較均勻，結構清晰，增厚不明顯；滋腎通竅飲低劑量組、導升明組、滋腎通竅飲高劑量組對視網膜毛細血管的病理損害保護作用逐漸增強，主要體現在基底膜增厚的差異，這提示滋腎通竅飲可抑制視網膜毛細血管基底膜增厚，對視網膜毛細血管起到保護作用，尤其是滋腎通竅飲高劑量組療效更佳，優于低劑量組表明本方的治療效果與藥物的劑量有關（圖1）。

圖1 滋腎通竅飲對視網膜毛細血管基底膜厚度變化的影響 （電鏡，×10K）。1A正常組；1B模型組；1C導升明組；1D滋腎通竅飲低劑量組；1E滋腎通竅飲高劑量組

糖尿病視網膜病變屬于瞳神疾病的范疇，在五輪學說中瞳神屬水輪，內應于腎，肝腎同源，肝開竅于目，肝受血而能視，“五臟六腑之精氣，皆稟受于脾，貫于目”“氣脫者，目不明”。DR屬慢性病，發生于糖尿病中后期，久病及腎，病久則肝氣不舒，肝郁乘脾，脾虛失運，聚濕生痰，脾不統血，血溢脈外。近年來的文獻發現，DR的治療所選用的單味中藥以補益藥和活血化瘀藥為多，補益藥以滋補肝腎、益氣養陰為主[14]。滋腎通竅飲以山萸肉、菟絲子、桑椹子、枸杞子、女貞子、石斛滋補肝腎生精血；黃芪、太子參、云茯苓等益氣養陰，健脾滲濕；旱蓮草、澤蘭、田七、丹參等活血止血；柴胡、香附、石菖蒲，疏肝通竅；升麻、葛根輕清上目，引藥上行。而且本方中所選的菟絲子、女貞子、葛根等有效成分有水飛薊賓、槲皮素、黃芩甙、柚皮素等具有抑制醛糖還原酶作用，而前兩者均含有中藥黃酮類成分，有抑制蛋白非酶糖化作用，有抑制GH作用[15-19]。實驗結果示滋腎通竅飲有改善STZ誘導DM大鼠的血清GH升高的作用，抑制視網膜毛細血管基底膜增厚。滋腎通竅飲對視網膜毛細血管起到保護作用機理可能是通過降低DM大鼠的血清GH水平，抑制視網膜毛細血管基底膜增厚，實現對視網膜毛細血管起到保護作用。