血清維生素D水平與體外受精-胚胎移植長方案新鮮周期妊娠結局的相關性研究

王馥新，高靚，石燕，李紅*

(1. 南京醫科大學附屬蘇州醫院，蘇州市立醫院本部生殖與遺傳中心，蘇州 215000； 2. 南京醫科大學附屬蘇州醫院，蘇州市立醫院本部檢驗科，蘇州 215000)

維生素D(vitamin D，Vit D)是一種脂溶性維生素，主要調節人體鈣磷平衡，促進骨礦化。它有VitD2和VitD3兩種形式，其中VitD3占人體總量的90%～95%。在紫外線的作用下，皮膚中的7-脫氫膽固醇轉化為前體VitD3，然后在體內迅速轉化為VitD3。這種VitD3無活性，需經兩次羥基化才有生物學活性。在肝臟第1次羥基化，產生25(OH)D3，在腎臟經1α羥化酶發生第2次羥基化，產生生物活性代謝物1，25(OH)2D3。近年來越來越多的證據表明，維生素D除了經典的調節骨骼鈣磷代謝的作用外，也存在其他作用。

研究發現，人體卵巢、胎盤、子宮內膜均含有1α羥化酶[1]，能代謝合成有活性的1，25(OH)2D3；同時，卵巢顆粒細胞[2-3]、子宮內膜細胞、子宮蛻膜[4]、胎盤[4-5]、輸卵管上皮細胞及垂體[6]均存在維生素D受體(VDR)。維生素D在生殖領域的功能日益受到重視。動物實驗表明，維生素D缺乏的小鼠，其卵母細胞成熟受阻、子宮發育不全，不孕癥及妊娠期并發癥發生率增加[7-9]。近年來，在IVF領域，維生素D對妊娠結局的影響也備受關注，但目前爭議較多，未達成共識。本研究旨在探討HCG日次日患者血清維生素D水平與IVF新鮮周期妊娠結局的相關性，探討維生素D能否作為預測IVF妊娠率的指標。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年3月至2018年2月在蘇州市立醫院本部生殖中心因輸卵管因素接受IVF/ICSI長方案治療并新鮮周期移植、年齡<35歲的不孕癥患者，共147例。排除PCOS、卵巢功能減退、子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥、高泌乳素血癥、子宮畸形、甲狀腺功能異常等其他內分泌疾病及全身疾病。

二、分組

1.按維生素D水平分組：按目前國際普遍接受的北美內分泌協會對維生素D缺乏狀態的定義[10]，由25羥化酶在肝臟代謝為25羥維生素D[25(OH)D]是血液循環中濃度最高的維生素D衍生物，包括25(OH)D2和25(OH)D3，因其不受攝取的鈣的量所影響，而且半衰期長，故可代表體內維生素D的狀態，被認為是評價體內維生素D水平的最佳指標。若測出的總25(OH)D值≥30 ng/ml(75 nmol/L)，說明維生素D充足；如<20 ng/ml(50 nmol/L)說明維生素D缺乏；總25(OH)D值介于20～30 ng/ml之間，定義為維生素D不足。依此標準，將納入患者分為3組。

2.按季節分組：因人體血清維生素D水平主要與日照強度相關，進一步將納入人群按冬、春、夏、秋四季分組。

3.按妊娠結局分組：為進一步比較血清維生素D與IVF新鮮周期妊娠結局的影響，按臨床妊娠結局分為妊娠組及未妊娠組。

三、促排卵及胚胎移植回顧

自月經第3天口服避孕藥(達英-35，拜耳，德國)15 d，皮下注射短效GnRH-a(達必佳，輝凌制藥，瑞士)，降調14 d；根據血清FSH、LH、E2、孕酮(P)水平，及陰道B超監測竇卵泡情況，符合降調標準者(FSH<5 U/L，最大竇卵泡平均直徑<5 mm)開始給予促性腺藥物刺激，至少3個卵泡直徑≥16 mm時，當晚注射重組人HCG(艾澤，默克雪蘭諾，德國)250 μg；36 h后行經陰道穿刺取卵術。所有患者均于取卵次日起每日肌注黃體酮60 mg支持黃體。取卵后3 d，若患者無明顯OHSS征象，當日在超聲引導下移植D3胚胎1～2枚。移植后12 d抽血檢測β-HCG，陽性者于移植后25 d行陰道B超檢查，見胎心搏動為臨床妊娠。

于HCG日次日清晨空腹靜脈采血，采用雅培Abbott ARCHITECT i2000sr自動免疫分析儀(雅培，美國)，化學發光微粒子免疫分析法測定血清25(OH)D水平。

四、觀察指標

比較各組間年齡、不孕年限、體重指數(BMI)、基礎內分泌等一般情況；獲卵數、MII卵率、優胚率、移植胚胎數等實驗室指標；Gn總天數、Gn總劑量、移植日子宮內膜厚度、獲卵數、臨床妊娠率、早期流產率、異位妊娠率等臨床指標。

五、統計學方法

結 果

一、不同血清維生素D水平組比較

出于分組標準，三個水平組間的血清維生素D水平有統計學差異(P<0.05)；三組間患者平均年齡、不孕年限、體重指數、基礎FSH、基礎LH、基礎E2、AMH均無統計學差異(P>0.05)；三組間胚胎實驗室指標(獲卵數、MII卵率、優質胚胎率、移植胚胎數)均無統計學差異(P>0.05)；三組間妊娠結局相關指標(臨床妊娠率、異位妊娠率、活產率)亦均無統計學差異(P>0.05)；早期流產率絕對數值隨維生素D水平升高而降低，但無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同血清維生素D水平組間一般情況及妊娠結局比較[(-±s)，%]

注：與其他兩組比較，*P<0.05

二、按季節分組比較

因人體內90%的維生素D來源于光照后皮膚的轉化，蘇州地處長江中下游平原，一年中日照呈現四季變化，季節因素是影響維生素D水平的主要因素。因此進一步按四季分組比較。各季節組間患者一般資料無統計學差異(P>0.05)；冬季及春季患者維生素D水平顯著低于夏秋季(P<0.05)，冬季組臨床妊娠率絕對數值較低，但各組患者間臨床妊娠率、流產率、異位妊娠率等妊娠結局相關指標均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

三、按臨床妊娠結局分組比較

按臨床妊娠結局，分為妊娠組(79例)和非妊娠組(68例)。兩組間HCG次日血清維生素D水平無統計學差異(P>0.05)；同時，兩組在年齡、不孕年限、體重指數、基礎FSH、LH、E2、AMH等一般情況均無統計學差異(P>0.05)；促排卵天數、藥物總劑量、獲卵數、移植日內膜厚度均無統計學差異(P>0.05)；妊娠組優質胚胎率數值上高于未妊娠組，但無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表2 按季節分組各組一般情況及臨床結局比較[(-±s)，%]

注：與夏、秋組比較，*P<0.05

表3 妊娠組與未妊娠組一般情況比較[(-±s)，%]

討 論

維生素D在女性生殖生理中發揮著重要作用，國內外關于維生素D與IVF臨床妊娠結局相關性研究較多，但結論不一。Ozkan等[11]對84例接受IVF治療的不孕婦女的研究發現，血清和卵泡液中的維生素D水平高者，胚胎種植率及臨床妊娠率均高，卵泡液中維生素D含量每增加1 ng/ml，臨床妊娠率增加6%，作者認為維生素D是預測IVF周期成功的獨立因素。Budick等[12]回顧性分析了99例供卵凍融胚胎移植周期，維生素D含量充足的患者臨床妊娠率高于維生素D缺乏者，推測維生素D可能是通過影響子宮內膜容受性而影響臨床妊娠率。一項對188名接受IVF治療的患者的回顧性研究顯示，美國非西班牙裔白種人中，血清維生素D水平與妊娠結局正相關，而在亞裔患者中無明顯相關性[13]。然而，Franasiak等[14]研究了移植優質囊胚的患者中血清維生素D水平與妊娠結局的關系，提示兩者不相關。Aleyasin等[15]則認為高水平維生素D與IVF妊娠結局呈負相關，卵泡液維生素D水平較高患者獲卵數略增加，其胚胎質量卻較維生素D水平低者更差。

我中心HCG日扳機后12 h常規留取患者血清測定激素變化情況，因此本研究中選取此日同時留取的患者血清測定血清維生素D水平，在不增加患者痛苦的同時，該日血清維生素D水平與取卵日及胚胎移植日的血清維生素D水平更接近，更具參考意義。我們按國際普遍接受的北美內分泌協會維生素D分組標準，將輸卵管因素接受IVF治療的患者分為“維生素D缺乏組”、“維生素D不足組”、“維生素D充足組”，比較發現年齡<35歲、因輸卵管因素行IVF助孕患者中，維生素D充足者僅占24.48%，維生素D缺乏狀態較為普遍。蘇州地區，不同季節，患者體內維生素D 水平呈現較大波動，冬春季節因日照較少，維生素D水平較低。無論是根據北美內分泌協會維生素D營養狀態分組，還是按季節進行分組，各組患者間一般情況相似，具有可比性，然而組間成熟卵率、優質胚胎率、臨床妊娠率、異位妊娠率等指標，差異均無統計學意義。

值得注意的是，本研究數據提示早期流產率絕對值隨維生素D水平升高而逐漸降低，維生素D缺乏組為9.34%，維生素D不足組為4.41%，維生素D充足組為2.78%。維生素D能作用于子宮內膜VDR，上調著床相關基因如HOXA10表達[16]。徐士儒等[17]研究發現，維生素D能降低復發性流產患者外周血NK細胞毒性，降低復發性流產患者流產率。有文獻報道，維生素D能調節母胎界面免疫狀態，使局部免疫平衡從TH1向TH2傾斜，有利于妊娠的維持[18]。這可能是早期流產率隨維生素D水平增高而降低的原因。但遺憾的是，由于本研究樣本量較小，早期流產率在不同維生素D水平組并無統計學差異。

上述分組標準參照的是北美內分泌學會的建議，主要適用于評價骨質疏松、鈣磷代謝的狀態，在不孕癥人群中是否適用，目前尚無證據。因此，我們進一步按臨床妊娠結局分為“臨床妊娠組”及“未妊娠組”，兩組年齡、體重指數、不孕年限、基礎內分泌等背景情況相似，但兩組HCG日次日血清維生素D水平分別為(24.05±7.59)ng/ml、(25.27±7.10)ng/ml，十分接近。較多證據表明維生素D缺乏可能與PCOS和子宮內膜異位癥的發病相關。維生素D參與胰島素代謝，維生素D缺乏會引發胰島素抵抗，因此維生素D缺乏可能會導致PCOS的發生[19]。同時，維生素D具有免疫調節及抗炎功能，參與子宮內膜異位癥的發生發展。體外實驗結果顯示，1，25(OH)2D3能上調IL-8及前列腺素的表達，進而顯著對抗IL-1β及TNF-α誘導的炎癥反應，對抗子宮內膜異位癥患者局部的免疫異常[20]。本研究的研究對象為僅為輸卵管因素所致不孕的年輕女性，不包含PCOS和子宮內膜異位癥患者，因而可能輸卵管因素人群妊娠結局與維生素D缺乏狀態關聯性較小，導致“妊娠組”與“未妊娠”組間維生素D水平不存在差異。

卵泡液中25(OH)D水平較外周血循環更能反映卵泡局部微環境的情況，但目前結果也不一致。Antunes等[21]認為卵泡液中維生素D水平越低，卵母細胞質量越好；Farzadi等[22]則認為，卵泡液中維生素D水平與IVF種植率及IVF妊娠結局呈正相關。而另有學者認為無論血清維生素D抑或卵泡液維生素D水平與IVF妊娠結局均不存在相關性[23]。以上這些學者測定的均是25(OH)D，然而卵巢局部或是子宮內膜局部有活性的1，25(OH)2D3水平更能直接說明維生素D對妊娠結局的影響，但目前對于1，25(OH)2D3尚無很好的檢測手段。本研究中未能測定卵泡局部的維生素D水平，且目前尚缺乏有效手段檢測維生素D活性產物1，25(OH)2D3的水平，這也是造成本研究中維生素D水平對組間妊娠結局無影響的可能因素。

此外，最近兩篇薈萃分析結果提示，血清維生素D水平不影響IVF臨床妊娠率，但維生素D缺乏患者其持續妊娠率和活產率低于維生素D充足者[24]。維生素D本身參與調節胎盤功能，參與妊娠[25]。本研究中因部分患者尚無最終妊娠結局，未能比較組間最終活產率的差異。但檢索現有文獻，未查詢到比較血清維生素D水平在IVF受孕婦女及自然受孕婦女間對圍產結局的影響。我們推測維生素D水平可能與妊娠本身相關，對妊娠中晚期的影響更大，而與IVF這項技術本身關聯性較小，但仍需進一步深入探討。

綜上所述，本研究結果提示，HCG日次日血清維生素D水平與因輸卵管因素行IVF新鮮移植周期妊娠結局不相關，無法預測其妊娠結局。但由于研究對象病因及樣本量的局限性，對維生素D與IVF妊娠結局的影響仍需更多更深入的研究。