DNA甲基化與糖尿病腎病的研究進展

陳林娜 張 鵬 王漢民

近年來，隨著我國居民生活水平逐步提高、飲食方式的改變和人口老齡化趨勢的加劇，糖尿病以及糖尿病腎病的發生率和病死率呈逐年上升趨勢，目前糖尿病腎病已成為導致尿毒癥的最主要病因之一[1]。糖尿病腎病的發病機制復雜，可能涉及遺傳因素、氧化應激、糖代謝異常、血流動力學異常、炎性損傷等多種機制，但以上因素尚不能完全解釋糖尿病腎病的發生機制[2]。近年來的研究發現表觀遺傳變異可能在糖尿病腎病的發生、發展中扮演了關鍵角色。其中DNA甲基化目前研究較為深入，本文現就DNA甲基化的研究進展及其與糖尿病腎病之間的關系做一綜述，以期為糖尿病腎病的臨床診治提供新的理論依據。

一、代謝記憶、表觀遺傳變異和糖尿病腎病

Zoungas等[3]研究發現，針對2型糖尿病患者，給予強化血糖管理，其益處可以持續到干預停止后的相當長一段時間，存在 “遺贈效應”；而早期暴露于高血糖水平的患者，即使疾病后期接受強化血糖控制，糖尿病導致的微血管并發癥仍持續進展，存在 “代謝記憶”現象，而這種“代謝記憶”現象與表觀遺傳修飾密切相關。表觀遺傳變異(epigenetic variation)是指在基因的DNA序列沒有發生改變的情況下，基因功能發生了可遺傳的變化，并最終導致了表型的變化。

表觀遺傳修飾涉及DNA甲基化、非編碼RNA、基因組記憶、基因沉默、組蛋白轉錄后修飾等，目前DNA甲基化研究較為深入。

二、DNA甲基化與糖尿病腎病

1.啟動子區DNA 甲基化與糖尿病腎病有關：DNA甲基化是指通過DNA甲基轉移酶(DNA methyltranferase，DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosy-methionine，SAM)作為甲基供體，再將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶的過程。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)雙核苷酸序列的胞嘧啶上。DNA甲基化可以引起DNA構象、染色體結構、翻譯過程發生改變，最終可以在不改變基因組堿基序列的前提下實現對基因表達的調控。CpG的甲基化與否起著十分重要的作用，CpG雙核苷酸雖只占人類基因組的10%，但約>80%的CpG雙核苷酸處于甲基化狀態，未發生甲基化的余下的 CpG 雙核苷酸分布在啟動子區和第一外顯子區。啟動子區 DNA 甲基化可以抑制基因的表達，進而影響轉錄和選擇性剪切。此外，啟動子區的DNA甲基化還可影響沉默子和增強子等轉錄活性因子的活性[4]。文利等[5]報道了糖尿病腎病患者中微小RNA(miRNA)中let-7a家族基因啟動子區域甲基化水平存在異常，通過檢測甲基化位點，發現let-7a-3 啟動子區域高度甲基化很可能是糖尿病腎病患者let-7a-3及let-7a低表達的一個重要因素，并促進了糖尿病腎病的發生和發展。還有研究者發現，結締組織生長因子(CTGF)是推動糖尿病腎病患者腎間質纖維化進程的關鍵細胞因子。糖尿病腎病患者腎小球CTGF的表達明顯升高，與持續高血糖水平降低了CTGF相關基因啟動子區 CpG甲基化水平有關[6]。總之，啟動子區 DNA 甲基化能通過多種機制導致基因沉默，廣泛參與了多種生理過程如細胞周期調控、基因印記、X染色體失活等。

2.糖尿病腎病患者全基因組甲基化整體水平明顯增加：Maghbooli等[7]通過反向高效液相色譜法(RP-HPLC)研究發現，糖尿病腎病患者相比于單純糖尿病患者的基因組整體甲基化水平明顯升高。近年來還有研究發現糖尿病患者基因組異常的DNA 甲基化修飾可使胰島素相關基因的表達、信號轉導發生改變，從而影響整個疾病進程。有研究對單純糖尿病與糖尿病腎病患者全基因組的甲基化水平進行了比較，兩組患者的基因組甲基化水平呈現出顯著性差異，其中單純糖尿病患者的基因甲基化程度相對較低，提示 DNA甲基化可能與糖尿病腎病的發病機制有關[8]。此外，王曉楠等[9]利用全基因組甲基化測序進一步證實了DNA甲基化與糖尿病腎病的關系密切。實驗收集了糖尿病腎病患者、糖尿病非腎病患者和正常人腎臟組織標本進行檢測，結果顯示，糖尿病腎病患者全基因組CpG 甲基化水平明顯高于其他兩組患者，進一步對3組患者差異甲基化區域(DMR)數關聯到的差異基因進行差異基因功能分類注釋(GO)分析和差異基因生物學路徑(KEGG)分析，整合素相關差異基因(FOXC1、ITGA8、MYLK3、FGF9、COL4A3、FLT1、MYC)等62個基因甲基化水平與表達水平呈負相關，并通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號通路發揮作用。以上表明了DNA甲基化可能在糖尿病腎病的發生、發展中起著關鍵作用。

3.DNA甲基化與炎性損傷:有研究發現,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)等炎性因子啟動子區的甲基化水平與其表達水平呈負相關，IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10、IL-11啟動子區的低甲基化可以上調上述炎性因子的表達水平，從而促進炎性反應的發生或提高炎性水平；有些炎性因子可以增加DNA甲基化轉移酶的活性，進而引起DNA異常甲基化。Bomsztyk等[10]更進一步研究證實，糖尿病腎病患者的IL-1β、TNF-α 和IL-17啟動子的區低甲基化可能直接與腎組織炎性水平有關。還有研究認為，糖尿病腎病患者中，促炎轉錄因子(NF-κB)活性增加，而表觀遺傳修飾對高糖誘導的NF-κB的激活、糖尿病并發癥相關炎性基因在血管細胞和單核細胞中的表達均有作用。此外，叉形頭轉錄因子3(FOXP3)是促進調節性T細胞(Treg)成熟和調節其功能的重要因子，在維持機體免疫耐受和免疫抑制中扮演了關鍵角色。Fontenot等[11]研究發現，FOXP3基因過度甲基化可能是糖尿病腎病免疫失調的重要原因之一，FOXP3基因啟動子區的高度甲基化可以下調FOXP3蛋白的表達，繼而削弱了Treg細胞的免疫抑制功能，加劇了糖尿病腎病患者的免疫失調和炎性損傷。上述研究表明DNA甲基化與糖尿病腎病的炎性損傷有密切關系。

4.DNA甲基化與氧化應激：持續高血糖和TGF表達水平升高均可導致過氧化應激，從而損傷腎小球和腎小管細胞，糖代謝紊亂還可使機體維生素C、維生素E和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化劑水平下降，削弱了機體抗氧化能力。此外，氧化應激還可上調一系列炎性細胞因子的表達，提高機體炎性水平，而炎性反應水平的升高也會反過來刺激氧化應激水平進一步增加，形成惡性循環[12]。凝固酶活性蛋白C可通過抗氧化作用而起到降低腎組織氧化應激損傷的作用，原癌基因shc編碼的蛋白(p66shc蛋白)其水平升高可加劇高血糖所致的細胞損害，Shahzad等[13]研究發現，凝固酶活性蛋白C水平下降可使p66shc基因啟動子區甲基化水平下降并使p66shc蛋白表達上調，提示凝固酶活性蛋白C可能調節p66shc基因甲基化水平，從而影響糖尿病腎病的發生和發展。Swan等[14]比較了單純1型糖尿病患者與糖尿病腎病患者的基因組跨越450K和27K甲基化序列，結果發現兩組患者線粒體功能相關基因(PMPCB、TSFM、AUH)的甲基化水平差異顯著，而線粒體應激、內質網應激與糖尿病腎病的發生、發展有一定關系，表明基因甲基化異常與1型糖尿病腎病密切相關。但總體而言，關于DNA甲基化與氧化應激損傷在糖尿病腎病中關系的研究報道尚不多見，二者的聯系需要更多的研究進一步證實。

5.DNA甲基化與腎臟纖維化：糖尿病腎病主要病理改變表現為腎小球基膜增厚、腎小管間質纖維化、細胞外基質蛋白沉積增多、系膜擴張，最終導致腎小球完全硬化[15]。有研究者發現，糖尿病腎病、慢性腎衰竭患者腎小管細胞全基因組DNA中纖維化相關基因甲基化水平與正常人比較差異顯著，提示DNA甲基化在腎臟組織纖維化過程中扮演了重要角色[16]。研究證實，持續的高血糖水平可誘導腎臟固有細胞內轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達上調，病理條件下，TGF-β1 可誘導多種細胞表型轉化和異常增殖，趨化成纖維細胞和單核細胞，繼而增加細胞外基質蛋白的沉積，促進纖維化進程[17]。多項研究發現，TGF-β1 基因低甲基化水平是 TGF-β1 蛋白高表達的分子基礎，TGF-β1 基因調控區存在一個橫跨啟動子及第一外顯子區的 CpG序列，而對該CpG序列的甲基化修飾主要發生于第一外顯子區。張倩等[18]研究證實，糖尿病腎病患者TGF-β1第一外顯子區甲基化水平較健康人群和單純糖尿病患者顯著下降，這種DNA甲基化水平的異常下降與TGF-β1的過度表達存在一定的因果關系，并最終參與了腎臟纖維化過程。調控蛋白水解活性與細胞外基質蛋白沉淀的酶系(NMMPs)通過降解腎細胞外基質中膠原和非膠原成分而對腎細胞外基質沉淀-降解的動態平衡發揮調控作用。馮詩雅[19]研究發現，糖尿病腎病患者的基質金屬蛋白酶家族相關基因(MMP-9)啟動子區甲基化水平明顯降低，而MMP-9的表達水平則顯著升高，且患者的MMP-9啟動子區去甲基化程度與其腎病病程呈正相關，并與腎小球濾過率(GFR)呈負相關，上述研究結果證明MMP-9啟動子區甲基化促進了MMP-9蛋白的表達，從而推動了糖尿病腎病患者腎臟纖維化進程。上述研究表明，DNA甲基化可能與糖尿病腎病的腎臟纖維化密切相關。

6.DNA甲基化與細胞凋亡：腎小管上皮細胞、腎小球固有細胞、足細胞凋亡均屬于糖尿病腎病的重要特征，并參與了糖尿病腎病的發病及進展。腎病相關基因(UNC13B基因)介導了高血糖水平下腎小球固有細胞的凋亡，有研究證實，1型糖尿病腎病患者UNC13B基因啟動子CpG島的甲基化水平出現了異常降低，同時觀察到UNC13B呈高表達，由此推測，UNC13B基因的甲基化異常可能促進了腎小球細胞的凋亡，從而參與了糖尿病腎病的發病與進展[20]。

7.DNA甲基化與非編碼RNA：非編碼RNA(ncRNA)是指不被翻譯成蛋白質的一類功能性RNA，可粗略分成兩類：(1)短鏈ncRNA：主要為微小RNA(miRNA)，其他的有Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、小干擾RNA(siRNA)等。(2)長鏈ncRNA(lncRNA)。 miRNA是一類長度約21～23個核苷酸的非編碼小RNA，它參與多種疾病的進程，其中包括糖尿病腎病的發生和發展。Gondaliya等[21]利用腎近端小管上皮細胞模擬建立了體外糖尿病腎病微環境的模型證實了miR29b可以靶向結合DNA甲基轉移酶(DNMT)。在高糖條件下，miR29b的表達下調，使得DNA甲基化特異性標志物(DNMT3A、DNMT3B、DNMT1)的表達水平提高，提示miR29b與糖尿病腎病發病機制中的DNA甲基化存在相關性。研究還進一步證實了miR29b可以顯著抑制糖尿病腎病中腎近端小管上皮細胞的腎損傷，具有一定的腎臟保護作用。此外，還有研究發現，在妊娠期糖尿病腎病患者胎盤組織中miR-98基因表達上調或下調后，DNA甲基化的水平隨后也發生了相關性的變化，通過進一步原位雜交檢測、定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)、蛋白免疫印跡實驗以及免疫組化檢測等驗證了miR-98可結合甲基cpG結合蛋白2(MeCP2)的3′-非翻譯區 (UTR)來抑制Mecp2的表達，從而使與葡萄糖攝取相關的基因TrPC3表達失調[22]。

綜上所述，DNA甲基化與糖尿病腎病的發病密切相關，現已證實DNA甲基化與糖尿病腎病發病過程中炎性損傷、氧化應激、腎臟纖維化、細胞凋亡、非編碼RNA等機制有關，對DNA甲基化的進一步研究有助于加深對于糖尿病腎病發病機制的理解。此外，由于表觀遺傳學修飾具有可逆性，DNA甲基化的相關研究為糖尿病腎病的防治提供了新的思路，有利于提高糖尿病腎病的臨床診治水平。