超聲引導下細針穿刺聯合FAM172A在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的應用價值

許培培 李梅芳 李連喜 郭明高

近年來，甲狀腺癌在全世界的發生率持續上升，其中最常見的類型為乳頭狀癌，約占所有類型的80%～90%[1]。超聲引導下細針穿刺(ultrasound-guided fine needle aspiration，US-FNA)是診斷甲狀腺結節的重要手段[2]。目前，超聲檢查已經成為甲狀腺癌早期診斷的重要方法。研究表明，超聲檢查的甲狀腺結節中，90%甲狀腺結節為良性，但對于惡性甲狀腺結節，超聲診斷的準確性仍需提高[3]。分子診斷的不斷發展，使發現早期惡性腫瘤成為可能[4]。

FAM172A 基因又名 C5orf21 基因，是一個結構和功能尚未明確的新基因[5]。本課題組從主動脈組織中克隆出了該基因，并初步研究了甲狀腺乳頭狀癌的影響，發現FAM172A在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達，并促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖[6]。本研究旨在通過免疫組化和US-FNA，進一步探索FAM172A蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價值。

資料與方法

1.研究對象：(1)回顧性選取2017年1月～2018年1月在上海交通大學附屬第六人民醫院外科進行手術治療的甲狀腺腫瘤患者的石蠟切片樣本共70例，其中50例為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer, PTC)，20例為甲狀腺腺瘤(follicular thyroid adenoma, FTA)。(2)前瞻性納入2018年1～6月在上海交通大學附屬第六人民醫院進行超聲檢查懷疑甲狀腺腫瘤的20例患者，通過FNA獲得細胞樣本。納入標準：①超聲和臨床表現可疑甲狀腺濾泡性腫瘤; ②原發性甲狀腺腫瘤患者，之前未接受過甲狀腺手術；③根據超聲檢查，甲狀腺結節>1cm；④患者自愿進行FNA檢查并簽署知情同意書。排除標準如下：①原因不明的出血病史; ②出血傾向(活化部分凝血活酶時間高于正常上限10s，凝血酶原時間高于正常上限3～5s，纖維蛋白原<1g/L，血小板計數<50000/mm3且聚集功能差，經臨床會診不能進行穿刺活檢)；③近期應用抗凝血藥物；④嚴重高血壓(收縮壓>180mmHg,1mmHg=0.133kPa)者；⑤超聲引導下不能確定活檢的合適部位。

2.方法：(1)常規免疫組化：將石蠟切片脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育5～10min，以消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃ 孵育1h。PBS 沖洗5min，重復3次。滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃ 孵育30min。PBS沖洗5min，重復3次。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min。PBS沖洗5min，重復3次。DAB顯色劑顯色15min。自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。(2)US- FNA：患者仰臥位，充分暴露頸前區。對暴露區域進行消毒，鋪巾。局部麻醉后，在超聲引導下進行穿刺，重復穿刺3～5次，吸出細胞樣本涂到玻璃片，涂3～4張，然后將涂片放到95%乙醇槽中固定。術后對穿刺點按壓10min止血。(3)細胞免疫組化：通過FNA穿刺取得細胞涂片樣本，經95%乙醇固定后，后續操作步驟同常規免疫組化。(4)FAM172A評分：染色結果由1位病理學工作者進行評估。具體方法如下，首先計算染色評分，在每張片子上隨機選取3～5個高倍視野，若細胞質或細胞核出現棕黃色則為陽性細胞。根據陽性細胞面積所占的百分比來進行評分：陽性面積≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。同時根據染色強度進行評分：0分為無染色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。然后將上述染色評分和染色強度評分相乘所得的結果作為最終的評定標準。

3.統計學方法：采用GraphPad Prism 5.0統計學軟件對所有數據進行統計分析和處理，采用t檢驗比較組間數據，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.回顧性分析FAM172A免疫組化鑒別乳頭狀癌：對50例PTC和20例FTA石蠟組織進行免疫組化。結果發現FAM172A蛋白在PTC組織中的表達顯著高于FTA中的表達(圖1)。同樣，FAM172A的染色得分在PTC中顯著高于FTA(圖2)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 FAM172A在甲狀腺腺瘤和乳頭狀癌中的表達(免疫組化染色，×200)A.甲狀腺乳頭狀癌；B.甲狀腺腺瘤

圖2 FAM172A免疫組化評分

2.ROC曲線分析FAM172A最佳截點：基于FAM172A的免疫組化染色評分，繪制ROC曲線，得出FAM172A評分為3.5是鑒別良、惡性甲狀腺濾泡性腫瘤的最佳臨界點，具有92%的敏感度和60%的特異性，曲線下面積為0.849(圖3)。

圖3 FAM172A細胞免疫組化診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線

3.前瞻性分析FAM172A細胞免疫組化鑒別甲狀腺乳頭狀癌：對20例疑為甲狀腺腫瘤患者進行超聲引導下FNA獲得細胞樣品，進行FAM172A的細胞免疫組化。根據術后病理結果，20例FNA樣本中有5例PTC和 20例FTA。FAM172A在PTC和FA中表達的代表性的免疫組化結果見圖4。免疫組化結果顯示FAM172A的表達在PTC中顯著高于FTA。

圖4 FAM172A細胞免疫組化在甲狀腺乳頭狀癌和腺瘤中的表達(免疫組化染色，×400)A.甲狀腺乳頭狀癌；B.甲狀腺腺瘤

4.FAM172A在甲狀腺腫瘤中免疫組化良惡性判定結果：FAM172A的免疫組化良、惡性判定結果見表1。FAM172A的免疫組化評分≥3.5被認為是PTC。根據免疫組化評分標準，5例PTC患者全部判定為陽性，15例FTA患者中有12例判定為陰性。最終FAM172A鑒別惡性和良性甲狀腺腫瘤的敏感度為100%，特異性為80%。

表1 FAM172A細胞免疫組化與術后病理比較 (n)

討 論

由于診斷技術的進步和各種環境因素的影響，全球甲狀腺癌的發生率明顯上升。有研究表明，我國的甲狀腺癌發生率顯著增加，年均增長率高達20.1%，主要類型為PTC[7, 8]。目前，超聲引導下FNAC是診斷甲狀腺乳頭狀癌的重要診斷方法，有著較高的敏感度和特異性，但由于細胞學的局限性，仍有10%～40%很難明確其性質。隨著分子標志物的不斷發展，越來越多的分子標志物應用到臨床診斷中[9～16]。

本研究發現，FAM172A在甲狀腺乳頭狀癌中高表達，并促進甲狀腺癌細胞的增殖[6]。FAM172A 在不同的腫瘤中可能發揮著不同的作用。本研究發現，超聲引導下FNAC聯合FAM172A細胞免疫組化有助于甲狀腺乳頭狀癌的診斷，其敏感度為100%，特異性為80%。有研究報道，US-FNA診斷甲狀腺乳頭狀癌的敏感度和準確性分別為70.7%和74.4%。進一步聯合BRAFV600E可提高甲狀腺乳頭狀癌診斷的敏感度(86.2% vs 70.7%)和準確性(87.9% vs 74.4%)[17]。另有研究結果表明，US-FNA診斷甲狀腺乳頭狀癌的敏感度為78.6%(33/42)，特異性為71.4%(20/28)，ROC曲線下面積為0.750。US-FNA聯合CK19和Ki-67，ROC曲線下面積可提高到0.858，聯合CK19和Ki-67檢測相比于單獨US-FNA具有更好的診斷價值[10]。與之前研究比較，FAM172A作為蛋白標志物有著更高的敏感度和特異性。

綜上所述，FAM172A作為一種新型蛋白分子標志物，能夠為PTC患者的確診提供參考，提高PTC診斷的準確性。但仍需開展更多的前瞻性、大樣本研究去驗證。