LDLR基因突變致家族性高膽固醇血癥家系分析

劉 軍 劉 芳

家族性高膽固醇血癥 (familial hypercholesterol-emia，FH)是一種以血漿總膽固醇(total cholesterol，TC) 和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C) 水平增高，機體不同部位皮膚/肌腱散發大小不等的黃色瘤、早發動脈粥樣硬化、早發冠心病為特征的常染色體遺傳性疾病, FH有雜合子型和純合子型兩種，發生率約1/500～1/200和1/30萬～1/16萬[1～3]。雜合子型主要是低密度脂蛋白受體(low density lip-oprotein receptor，LDL-R)、載脂蛋白 B(apolipoproteinB，ApoB)、枯草溶菌素轉化酶 9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)的功能改變，純合子型主要是 LDL-R 銜接因子蛋白 1(low density lipopro-tein receptor adaptor protein 1，LDLRAP1)功能改變所致[4]。

本研究報道了一個高膽固醇血癥家系4例患者的臨床表現、生化檢測及基因測定結果，證實該家系患者均存在LDL-R基因突變，現報道如下。

對象與方法

1.研究對象:先證者：4歲，女性，因發現身體不同部位皮膚出現大小不等的黃色凸起物就診。患兒系G3P2，孕40周順產娩出，羊水、胎盤、臍帶無異常，阿氏評分1、5、10min均為10分，無窒息搶救史。出生后母乳喂養，母自訴患兒平素身體健康，飲食無特殊嗜好。大約半年前患兒四肢皮膚多處出現深淺及大小不一的黃色凸起物，壓之不退色，不伴發熱，無心前區不適。無母孕期射線和服藥物史，患兒有一個姐姐11歲，一個弟弟1歲，二人體健，無皮膚黃色凸起物。父母非近親婚配，否認有遺傳病家族史。先證者入院查體：生命體征平穩，神志清，體重18kg，身高1.1m, 呼吸平穩，雙肺聽診無異常，心音有力，無雜音，腹部脊柱無異常，雙腿膝關節屈側肌腱處、小腿踝關節伸側屈側肌腱處、雙肘關節屈側肌腱處可見大小不一的黃色瘤(圖1), 雙眼有明顯角膜弓,心電圖、超聲心動圖正常。血TC 16.40mmol/L，高于正常3倍余，LDL-C 15.06mmol/L，高于正常近5倍，載脂蛋白B 2.78g/L高于正常2倍余(表1)。其他成員： 先證者父母、弟弟皮膚或肌腱未發現黃色瘤，也無其他臨床癥狀。心電圖、心臟彩超正常，但3個人血TC、LDL-C、載脂蛋白B均有不同程度的增高，只是增高幅度低于先證者。先證者姐姐臨床無癥狀，上述指標也無增高。

圖1 先證者踝關節伸側屈側肌腱附近、肘關節肌腱處、膝關節肌腱處大小不一的黃色瘤A.伸側肌腱附近；B.屈側肌腱附近；C.肘關節肌腱處；D.腱關節肌腿處

表1 先證者一家5口年齡、身高、體重及血脂檢測水平

2.外周血基因組DNA的提取：采集先證者、其父親、母親、姐姐、弟弟外周血各2ml EDTA抗凝，用QIAamp全血DNA提取試劑盒(德國Qiagen 公司)按其指南提取基因組DNA。以上獲得筆者醫院醫學倫理學委員會討論通過后，家長簽署了知情同意書。

3.醫學外顯子測序:DNA送第三方檢驗公司-北京邁基諾基因公司，對先證者及父母行醫學外顯子測序。使用Hiseq2000標準流程測序(二代測序儀：Illumina NextSeq500, 美國Illumina公司)。

4.序列比對，變異注釋和危害性預測:通過Q20標準對原始數據進行數據過濾得到Clean data，使用BWA比對軟件，將所有的Clean reads 比對到人參考基因組(HG19)；將分析得到的SNP和INDEL通過ANNOVAR軟件進行注釋。篩選掉正常人數據庫中頻率<0.05的突變位點， 用MutationTaster和GERP++軟件進行致病性預測和保守性預測，剪切位點的改變用SPIDEX軟件分析其致病性。

5.一代測序(Sanger法)驗證:篩選到的候選變異位點用PCR和Sanger測序驗證(ABI3730xl測序儀，美國Applied Biosystems 公司)。最后對先證者姐姐、弟弟行致病突變點的驗證。

結 果

1.先證者家系醫學外顯子測序分析：先證者樣本分析到 LDL-R 基因有 2個雜合突變：(1)在LDL-R基因的第5個外顯子上有一個雜合突變，即c.727T>A(編碼區第 727 號核苷酸由胸腺嘧啶變異為腺嘌呤)，導致氨基酸改變 p.C243S(第 243 號氨基酸由半胱氨酸變異為絲氨酸)，為錯義突變。該變異在正常人群數據庫無攜帶頻率。蛋白功能預測軟件 SIFT、PolyPhen_2、REVEL的預測結果均為有害。在 HGMD專業版數據庫中未見報道。經家系驗證分析，先證者之父該位點雜合變異，先證者之母該位點無變異。對先證者姐姐和弟弟進行驗證，結果顯示先證者弟弟該位點同先證者父親為雜合變異，先證者姐姐該位點無變異(圖2)。(2)在LDL-R基因的第7個外顯子上有一個雜合突變，即c.1003G>T(編碼區第 1003 號核苷酸由鳥嘌呤變異為胸腺嘧啶)，導致氨基酸改變 p.G335C(第 335號氨基酸由甘氨酸變異為半胱氨酸)，為錯義突變。該變異在正常人群數據庫無攜帶頻率。蛋白功能預測軟件 SIFT、PolyPhen_2、REVEL的預測結果分別為有害、有害、有害。在 HGMD專業版數據庫中未見報道。經家系驗證分析，先證者之父該位點無變異，先證者之母該位點雜合變異。對先證者姐姐和弟弟進行驗證，結果顯示先證者姐弟倆該位點均無變異(圖2)。

圖2 先證者、父母、姐姐及弟弟DNA測序圖A.先證者測序圖;B.先證者父親測序圖;C.先證者母親測序圖;D.先證者姐姐測序圖;E.先證者弟弟測序圖;箭頭指示為突變位點

2.隨訪：先證者父母經過4個月飲食控制加鍛煉，TC、LDL-C有所下降，但仍然高于正常，后加用阿托伐他汀鈣 20mg, 每晚1次,口服，2周后復查兩人TC分別降至 4.2mmol/L和4.8mmol/L，LDL-C分別降至2.7mmol/L 和3.0mmol/L。先證者經過4個月飲食控制加鍛煉，復查血TC 14.10mmol/L，LDL-C 11.74mmol/L，較前有所降低。由于患兒皮膚黃色瘤有所增多，家長十分焦慮。與家長協商后，試給患兒加用阿托伐他汀鈣 5mg, 每晚1次，口服，2周后TC降至11.46mmol/L，LDL-C降至9.82mmol/L，繼續維持現在劑量口服2周，必要時考慮增加到10mg, 每晚1次，口服，目前筆者還在密切隨訪先證者。先證者弟弟1歲余，主要吃奶和添加輔食，囑少食內臟食物，最近1次復查TC為6.42mmol/L,LDL-C為4.06mmol/L。

討 論

FH是一種常染色體顯性遺傳病，主要表現為血漿LDL-C水平異常升高，肌腱黃色瘤，以及早發冠心病。中華醫學會心血管病學分會動脈粥樣硬化及冠心病學組制定了中國FH篩查與診治中國專家共識[5]。共識指出兒童FH診斷標準：未經治療的血清LDL-C≥3.6mmol/L且一級親屬中有FH或早發冠心病。本先證者及弟弟血清LDL-C分別是15.06mmol/L和5.04mmol/L，結合家族史，符合兒童FH診斷標準。共識對成人FH診斷標準是：符合下列3條中的2條：①未經治療的血清LDL-C≥4.7mmol/L；②皮膚/腱黃色瘤/脂性角膜弓(<45歲)；③一級親屬中有FH或早發動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)患者。先證者父母血清LDL-C分別為4.49mmol/L和5.97mmol/L，結合家族史符合成人FH診斷標準。FH 可分為純合子和雜合子兩種類型，雜合子癥狀通常較輕，而純合子癥狀嚴重，表現為多部位黃色瘤、發展迅速的全身動脈粥樣硬化，青少年時期發生心肌梗死甚至死亡。本家系中先證者LDL-R基因存在2個復合雜合變異，屬于純合子，變異的基因分別來自父母，其他家庭成員除了姐姐正常，LDL-R基因僅存在1個位點的突變，屬于雜合子。

從臨床上看，先證者血清LDL-C水平遠高于正常范圍，也高于其他家庭成員，這點也符合純合子的特點，膽固醇代謝涉及了許多蛋白質和途徑，LDL分解代謝是該過程中的關鍵點，參與其中的蛋白質功能發生任何缺陷都可以產生FH。其中起主要決定因素的為LDL-R，占FH病例的80%～85%，載脂蛋白B占5%～10%的病例，枯草溶菌素轉化酶9占 2%，LDL-R銜接因子蛋白占不到1%的病例，其余的少見[4]。目前文獻報道發現 LDL-R、載脂蛋白B、枯草溶菌素轉化酶9、LDL-R銜接因子蛋白、固醇調節元件結合蛋白2、三磷酸腺苷結合盒轉運體、膽固醇 7α-羥化酶這7 種基因突變可導致 FH，我國目前僅發現了前3種基因突變[3]。

LDL-R基因位于染色體19p13.2，由 18個外顯子和 17個內含子組成, 包含 5個不同的功能域,當外顯子發生突變可使 LDL-R相應的功能域不同程度受損, 導致LDL-R的功能障礙。文獻報道LDL-R基因突變位點遍布啟動子, 內含子及18個外顯子中, 目前世界范圍已從 FH患者中檢測出了3000多種突變, 包括缺失、插入、無義突變、錯義突變、拷貝數變異等[4,6～8]。

LDL-R基因突變為 FH 主要病理基礎，LDL-R是一種富含半胱氨酸的839個氨基酸的蛋白質，是一種細胞表面糖蛋白，通過受體介導的內吞作用特異性結合并內吞含載脂蛋白B 100或載脂蛋白 E的脂蛋白,在膽固醇體內平衡中起重要作用。LDL-R基因突變導致細胞膜表面 LDL-R結構功能異常, 不能有效代謝體內LDL, 導致LDL因清除障礙而在血液或其他組織中過度淤積引發高膽固醇血癥[6,9,10]。

據相關文獻報道，中國FH 患者 LDLR基因突變均發生在 1～17 外顯子，第 18 外顯子突變尚未發現[11]。Chiou等[12]統計發現，在我國漢族人群中目前存在143種不同LDL-R突變類型(134種位點突變及9種基因重組)。2015年Jiang等[13]對中國 FH 人群基因情況予以概述，發現 LDLR 突變多位于外顯子 4、9、13 及 14，主要是錯義突變，占60.3%，C308Y、H562Y 和 A606T 突變最為常見。其中，我國內陸北方地區 A606T 突變最常見，內陸南方地區 W462X 突變最常見，臺灣地區 C308Y 最常見。2017 年 Li 等[14，15]對全國范圍內 245 例 FH 患者進行基因突變分析發現，在單基因突變FH患者中，LDL-R基因突變占68.2%，多位于外顯子12、4、9。

本研究中FH先證者LDL-R基因有2個雜合突變(復合雜合子)，一個位于第5號外顯子，一個位于第7號外顯子，分別來自父母，屬于純合子。這兩個突變c.727T>A (p.C243S)和c.1003G>T (p.G335C)均為錯義突變，在正常人群數據庫無攜帶頻率，蛋白功能預測軟件 SIFT、PolyPhen_2、REVEL的預測結果均為有害，上述變異在 HGMD專業版數據庫中未見報道，屬于新發突變。由于先證者本身存在黃色瘤、高膽固醇和高低密度脂蛋白膽固醇，分析該基因突變為致病性突變。先證者父母、弟弟各存在1個基因突變，屬于雜合子，3個人同樣存在血高膽固醇和高低密度脂蛋白膽固醇，只是程度較純合子的先證者輕。先證者姐姐臨床生化檢驗正常，基因測序未見LDL-R基因突變，符合共分離特征，因此可以判斷本家系中存在的FH致病因素是LDL-R基因突變所致。

為提高 FH 診斷率，應盡早對 FH 予以篩查，方法有人群篩查、選擇性篩查、家族級聯篩查、脂質級聯篩查、基因級聯篩查、反向級聯篩查等。Starr 等[16]建議在年齡>2 歲的兒童中篩查 FH，再進一步對確診兒童父母進行篩查，即進行反向級聯篩查，這種篩查的優點是大多數國家兒童有常規體檢，易實施。2017 年 Wu 等[17]在我國47例FH患者的1、2級親屬中進行反向級聯篩查發現，總篩查檢出比例為2.8例新診患者/1 例先證者，證實我國反向級聯篩查是高效的。

本研究報道的家系成員中，先證者作為兒童首先因為黃色瘤就診，隨后發現異常血脂增高，對其家中成員進行血脂篩查，結果父母、弟弟均不正常，僅姐姐正常。最后進行基因測定，證實家族中除了姐姐，其余成員均存在LDLR基因突變，且先證者為復合雜合突變，即存在兩個位點的突變，屬于純合子，此檢測結論也驗證了先證者臨床癥狀突出、血脂異常明顯的特點。

FH 的治療包括生活方式和飲食控制、藥物治療、脂蛋白血漿置換以及肝臟移植等[18]。成人 FH 患者一旦確診應立即改變生活方式并開始藥物治療如他汀類藥物、膽汁酸螯合劑等，對于純合子患者及患有冠心病并對其他治療無效的雜合子患者采取血漿清除。本研究先證者父母屬于雜合子，臨床沒有癥狀，心電圖和心臟超聲均正常，治療最初依靠飲食和鍛煉，但血膽固醇不能降至滿意，加用阿托伐他汀鈣口服效果滿意。本研究先證者為4歲多兒童，依靠調整飲食效果不理想，且皮膚黃色瘤增多，試加用阿托伐他汀鈣5mg,每晚口服1次，目前血TC、LDL-C仍然比較高，由于患兒年齡小，筆者尚在密切隨訪治療效果，必要時調整藥物劑量為10mg,每晚口服1次。對于兒童患者，基于生長發育的考慮，無論純合子型還是雜合子型 FH，2 歲前均不宜應用低脂飲食，因此先證者弟弟僅囑少食動物內臟，其余未做特殊處理[4,19]。該研究不足之處是未對先證者皮膚黃色瘤予以病理學檢查，原因是患兒父母堅決反對。

對一家族性高膽固醇血癥家系進行醫學外顯子測定，結果顯示該家系5人中的4人存在LDLR基因突變，分別是5號外顯子c.727T>A 和(或)7號外顯子c.1003G>T，這兩種突變在正常人群數據庫無攜帶頻率，在 HGMD專業版數據庫中未見報道，提示對臨床出現不明原因皮膚黃色瘤，血膽固醇增高的兒童要積極尋找致病原因，對其親屬也應該積極進行相關檢測，及早做出診斷，給予干預，避免疾病進展。