細胞釋放的微粒的檢測方法研究進展

楊薈圓 路 明 張迎媚

微粒(MPs)是各種血液細胞、血管內皮細胞、腫瘤細胞受刺激活化或凋亡而釋放到血液循環中的直徑0.1～1.0μm的小泡狀膜顆粒[1]。當細胞活化或凋亡時，細胞膜脂質雙層不對稱性喪失，引起一系列的生物學變化，使細胞膜脫落形成MPs[2]。MPs不僅僅是簡單的細胞脫落物，它攜帶有其來源細胞的一些基本物質，主要包括脂類和蛋白質，也包含mRNA、microRNA，但沒有細胞核結構。各種細胞來源的MPs表面均攜帶有其母體細胞的特異表面抗原。MPs表面還有磷脂酰絲氨酸(PS)暴露，這一點與細胞不同。

MPs具有廣泛的生物學活性，其生物學特性在很大程度上取決于其蛋白質和脂質組成，而蛋白質組成又取決于其來源的細胞和導致其產生的刺激因素[3]。例如，來自內皮細胞的MPs (EMPs) 含有大量的代謝酶、參與細胞外滲的蛋白質和細胞骨架相關的蛋白質；血小板釋放的MPs (PMPs) 表面則富集整合素、p-選擇素等蛋白，而活化中性粒細胞來源的MPs中整合素Mac-1濃度較高[4]。MPs也可以作為細胞與細胞之間傳遞信號的媒介。MPs在炎癥、免疫、與癌癥相關的靜脈血栓栓塞 (VTE) 和血管等疾病的發生、發展中發揮著重要作用，對于這些疾病，檢測 MPs性質及水平有助于監測病情、指導治療及判斷療效[5，6]。但是，由于MPs 極小，常規檢測方法的敏感度和分辨率常常不夠，使得 MPs 的檢測受到很大限制。

本文介紹了許多檢測MPs的方法，用來確定的MPs直徑、數量、形態學、細胞來源和生物學活性。這些分析MPs的方法各有其優勢和不足，微粒檢測方法的標準化在技術方面還面臨極大挑戰。本文從定性和定量分析兩方面對MPs一些常用的檢測方法做一簡單介紹。

一、 定性分析方法

1.透射電子顯微鏡法(TEM)：TEM利用電子獲得樣本的二維圖像，它的特點是具有極高的分辨率(接近0.1nm)，可以用來評估MPs的直徑、膜的形態和組成[7]。使用膠體金標記的抗體可以獲得關于MPs抗原成分的信息[8]。

該方法需要通過超離心技術使樣品中的MPs濃縮，因此不能對原樣本中MPs的數量進行定量分析[9]；不能直接檢測血漿中的MPs，因為它需要對樣品進行固定和脫水，而這一操作過程對MPs的直徑和形態有著直接的影響[10]。該方法樣本制備過程非常耗時，而且鏡下檢測也需要幾個小時。因此本方法主要用于對MPs的直接觀察或對其他檢測進行驗證。

2.激光掃描共聚焦顯微鏡技術(LSCM)：LSCM是熒光顯微鏡的一個現代變異體，在激光掃描共聚焦顯微鏡中，使用激光做光源，與熒光顯微鏡比較，提高了圖像的分辨率；計算機代替了人眼或者照相機進行觀察、攝像，得到的圖像是數字化的，提高了圖像的清晰度；光電倍增管的應用，提高了檢測的敏感度。LSCM檢測前，先超速離心分離得到MPs，用PS的特異結合蛋白Annexin V固定MPs以阻止其布朗運動，然后用熒光素偶聯的抗體對MPs表面特異抗原進行標記[11]。此方法檢測結果取決于針對目標抗原的抗體的特異性和親和力，以及MPs表面抗原的密度。LSCM技術還能夠獲得MPs的直徑、形態和結構信息[12]。該方法的不足是耗時長(每個樣品需要分析幾個小時)，而且不能對血漿中的MPs直接進行檢測。

3.原子力顯微鏡檢測(AFM)：AFM是一種可以用來研究固體材料表面結構的分析儀器。它通過檢測待測樣品表面和一個微力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來研究待測樣本的表面結構及性質。將一對對微力極端敏感的微懸臂一端固定，另一端的微小針尖接近樣品，這時針尖將與樣品表面相互作用，作用力將使得微懸臂發生形變或運動狀態發生變化。掃描樣品時，利用傳感器檢測這些變化，就可以獲得作用力分布信息，從而以納米級分辨率獲得待測樣品表面形貌結構信息及表面粗糙度信息。AFM可以檢測單個MP，形成檢測樣品的三維圖像[13]。

該方法要求測量前將MPs從血漿或其他樣品中分離出來、濃縮，并使之緊密結合固定到載體平面上，這會影響MPs的形態和數量，也無法測得MP的直徑。云母是一種絕緣礦物，涂于載體平面表面，特異抗體再涂于云母表面，與MPs樣本孵育后，攜帶相應抗原的MPs即可緊密結合到載體平面上。該方法的優點是能提供真正的檢測樣品的三維表面圖；可以直接在液體環境中檢測MPs，使MPs維持在生理狀態。盡管AFM允許檢測MPs并確定其表型，但不能獲得關于MPs功能特性的信息；成像范圍太小；耗時費力(檢測一個樣本約需2h)。

二、定量分析方法

1.光學顯微鏡技術：光學顯微鏡的最高分辨率為200nm，比普通顯微鏡高50倍，可以看到檢測樣品的亞顯微結構，特別適合用來觀察微小的顆粒。光學顯微鏡結合圖像分析軟件可以對MPs進行定量分析，但很費時(分析10000 個MPs需要幾個小時)，并且這種方法不能提供關于MPs的細胞起源、抗原成分等方面的信息。

2.熒光顯微鏡技術：是將熒光與顯微鏡技術相結合的一種檢測技術，也是一種很有前途的MPs檢測技術。其利用熒光素標記的抗體檢測微粒表面特異的抗原，從而對微粒的特定屬性進行定量分析。這種方法同樣耗時較長(每個樣本平均檢測時間約為1h)，并且不能測量MPs的直徑。隨著光學成像技術的不斷進步，熒光顯微鏡是一種很有前景的MPs檢測技術，例如借助FITC-annexin V標記PS，熒光顯微鏡可以動態觀察MPs自細胞膜脫落、形成的過程[14]。但是，由于納米級MPs的快速布朗運動的存在，限制了該技術敏感度的提高[11]。

3.流式細胞術：流式細胞術是最常用的鑒定MPs、并對其進行定量分析的方法[15]。該方法檢測MP獲得兩部分參數：散射光強度和熒光強度(熒光偶聯于抗體上并進一步結合到特異的目標抗原上)。前向角散射光(FSC)強度反映細胞/MPs的直徑，而側向角散射光(SSC)強度提供待測細胞/MPs內顆粒結構復雜程度的信息[11]。使用已知大小的熒光素標記的標準微球，通過比較MPs與標準微球的FSC強度，可以確定MPs群[16]。使用已知濃度的熒光素標記的標準微球，將其添加到特定體積的MPs樣品中，通過計算檢測到的MPs與標準微球的數量比，可以確定樣品中MPs的濃度[17]。用針對細胞特異抗原的熒光標記的抗體對MPs進行染色，可以評估MPs的細胞來源。此外，使用熒光素標記的Annexin V，可以驗證MPs的磷脂分布特性，即MPs表面有PS的暴露[18]。

流式細胞術的一個主要優點是可以采用熒光素雙標甚至多標法測定MPs的起源。流式細胞術的另一個優勢是每秒可以分析成千上萬個MPs[19]。流式細胞術不需要檢測前從待測樣本中分離MPs，因此能很好地保留MPs的形態學特征，并防止MPs數量的丟失。然而，流式細胞術也有一些局限性：它沒有提供細胞形態學方面的詳細信息；受儀器分辨率的限制，絕大多數流式細胞儀不能檢測0.1～0.4μm直徑的MPs；小的MPs聚集成團，會被記為一個MPs；實驗重復性差；檢測結果受儀器的類型、設置、數據分析者的能力以及樣品的制備和儲存方法等影響較大[20]；雖然使用表面抗原特異抗體可以檢測MPs起源，但當MPs表面抗原的量少，同時伴有抗原抗體的結合能力相對弱時，特異性熒光強度較低，MPs可能不能被檢出。

4.基于阻抗的流式細胞術：該技術的工作原理也是目前普遍使用的血細胞分析儀的工作原理，又稱庫爾特原理。無論是血細胞還是MPs，都是電的不良導體。將待測樣本用電解液稀釋，懸浮于電解質溶液中的顆粒被抽吸而通過兩側置有兩枚電極的小孔的周邊。當控制通過該小孔電流時，小孔周邊會產生一個電感應區，隨著每個顆粒通過該電感應區，顆粒會置換出電感應區內等體積的導電液體，瞬間增加了該電感應區的電阻。這種電阻的變化經過一個放大器會產生一種成比例的電脈沖，儀器能夠對電脈沖進行精確的測量。這種脈沖的強度與產生它的顆粒的大小呈正比，因此就可以在幾秒鐘內對液體中的顆粒進行識別和計數。該技術的檢出下限為300nm，因此直徑<300nm的MPs不能檢出。該方法不能提供MPs的形態、細胞來源、功能等方面信息。

5.免疫印跡法(Western blot法)：MPs用裂解液裂解后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質，然后將凝膠上的蛋白質轉移到固相載體硝基纖維素膜或聚偏氟乙烯膜上，用針對特定抗原的一抗標記，再用針對一抗的帶有標志物的二抗孵育，最后標志物顯色，結合特定圖像分析軟件，即可定量MPs中特定抗原的表達量[21，22]。

Western blot法分析需要大量MPs，這限制了該方法應用于血漿MPs的檢測；另外，該法允許研究MPs的蛋白表達，但不能提供關于MPs直徑和數量的信息。

6.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)：ELISA是利用抗原抗體特異結合特性對樣本中特異蛋白進行定量分析的一種簡便易行的檢測方法。該方法重復性好，可用來定量分析MPs表面的抗原，也可以通過定量MPs表面攜帶的PS的量間接地定量MPs的數量[23]。包被于96孔板上的Annexin V或針對MPs表面特異抗原的抗體(捕獲抗體)，與血漿中MPs特異性結合后，用針對MPs表面特異抗原、與熒光素偶聯的抗體(檢測抗體)檢測被捕獲MPs的表面抗原的表達量；用與熒光素偶聯的Annexin V代替檢測抗體，可以檢測出MPs表面PS的總量，從而間接測定MPs的數量。

ELISA檢測MPs的優點為可以同時檢測很多樣本，是一種高通量檢測方法；沒有MPs直徑限制；能定量評估MPs數量。該方法也有一些缺點：僅能檢測可溶性抗原；不能提供MPs直徑的信息；存在Annexin V非特異性結合，使該方法的應用受到限制[24]。另外，該方法需要使用新鮮的血漿，因為凍融會引起MPs表面PS的數量增加。

7.用于定量MPs表面特定生物活性分子的功能實驗：本法是基于MPs的某些特定生物學功能對MPs特定性征進行定量分析。例如，PS具有促凝血活性，而MPs表面暴露有PS，因此，采用MPs促凝活性/促凝血酶生成活性檢測實驗，就可以間接測定MPs數量[2,25]。再如，MP-TF活性檢測實驗通過測定MP-TF依賴的凝血因子Xa的生成量，可以確定MPs表面攜帶的活性TF的量[26，27]。由于MPs表面攜帶的、有特定生物學活性、適合分析的分子種類很少，此類檢測方法數量十分有限。

功能實驗的優點是操作簡單，可以同時分析很多樣本，檢測的是樣本中全部MPs的功能，不受MPs直徑和來源的限制。該方法的不足是它們不能評估樣本中MPs的直徑及數量。

到目前為止，流式細胞術與功能實驗在MPs檢測方面獲得的數據不多，但兩種方法測定的結果一致性差。考慮到流式細胞術不能檢測直徑<400nm的MPs，而血漿中直徑<200nm的MPs在凝血過程中的作用不可忽視，那么從功能實驗和流式細胞術中得到的結果不一致是可以理解的。

三、MPs檢測方法的選擇

從上述介紹可以看出，每種檢測方法有其各自獨特的用途、優勢和不足，充分了解每種檢測技術是選擇適合的檢測方法的前提。針對不同的研究目的，結合不同的實驗室實際條件，可以選擇不同的檢測方法，來獲得研究者所需要的信息。比如，很多實驗常常需要同時獲得關于MPs數量與來源方面的信息。經上面分析可知，流式細胞術、ELISA都是可以選擇的能同時獲得這兩方面信息的方法。例如Sarlon-Bartoli等[16]在分析白細胞來源MPs的血漿水平與頸動脈高度狹窄患者的不穩定斑塊的相關性的研究中用高敏感度流式細胞儀測定血漿中不同MPs的細胞來源及數量。有研究者使用ELISA法對腦梗死慢性期患者血漿中的血小板來源MPs的水平進行了定量分析。還有一種技術，該技術的原理是將ELISA與定量MPs表面PS的功能實驗兩種檢測方法結合起來，也能達到同時獲得這兩方面信息的目的。Delabranche等即使用了這一技術對血漿中不同細胞來源的MPs在感染性休克引發的DIC中的數量變化情況進行了動態監測。另外，還可以將定性與定量分析方法聯合應用，利用每種分析方法的優勢，來彌補另一分析方法的不足。比如研究者采用透射電鏡和流式細胞術技術對急性呼吸窘迫綜合征大鼠血漿中不同細胞來源的微粒進行了定性、定量分析。再如Hughes等將正常人血小板置于肝素誘發的血小板減少癥患者血漿中，并加入肝素激活血小板，然后聯合使用電子顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細胞術等技術，對血小板釋放微粒情況進行定性、定量分析。

四、展 望

人血漿中循環MPs的發現具有重大意義，深入研究MPs的機制，可為臨床許多疾病包括心血管疾病、凝血相關疾病以及一些惡性疾病的診斷、病情評估、療效判定提供依據。近年來，關于MPs的分析方法多種多樣，但都存在一定的局限性，由于缺乏標準化的檢測方法，MPs研究需要進一步發展，用重復性好的方法測量MPs仍然是一個挑戰。目前流式細胞術似乎是研究MPs的最佳技術，因為它具有多參數分析的可能性，它不僅提供定量信息，而且提供定性信息，盡管有許多限制，它仍然是檢測和分析MVs最常用的技術。隨著技術的進步，硬件設施分辨率的逐漸提高，方法學的進一步完善和發展，MPs的檢測方法將會越來越標準化，這將會有效促進MPs在生理和病理情況下發揮作用的研究，也會進一步促進MPs在臨床疾病的診斷和治療中的應用。