茶樹成花機理研究進展

劉瑩，郝心愿，鄭夢霞，王新超，肖斌，楊亞軍*

1. 西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；2. 中國農業科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

茶樹[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]是山茶科山茶屬植物，起源于我國西南地區，后傳播于世界很多國家，是中國、印度、斯里蘭卡、肯尼亞等國重要的經濟作物。茶樹的生命周期很長，在其生命周期中，存在營養生長和生殖生長交替進行的現象，并且進入成年以后，營養生長和生殖生長存在相互競爭的關系。在遺傳層面，開花有利于維持物種的遺傳多樣性，在進化中占有優勢。在醫藥方面，茶花具有消炎、抗氧化、降血糖、助消化、抗癌等多重功效，因此具有廣泛的應用前景；在育種方面，幼年期短的品種有利于縮短育種時間，提高生殖生長可以促進結實率的提高，并提高雜交效率，開花結實多的品種有利于雜交育種；但對茶葉生產而言，生殖生長旺盛，則會消耗大量的養分，與營養生長形成不利的競爭關系，影響營養生長，進而影響茶葉的產量和品質，對茶葉生產極為不利。因此，研究茶樹花芽分化的調控機制，通過選育不開花或少花的品種，以及利用一定的栽培措施抑制花芽的分化以促進營養生長，平衡生殖生長和營養生長，對提高茶葉產量具有重要意義。本文梳理了近年來茶樹成花調控和花芽分化與發育的研究進展，提出了茶樹花芽分化研究的方向，為進一步解析茶樹花芽分化的機制提供參考。

1 開花誘導機制

植物通過接收的光周期和溫度信號，感受季節的變化，調控相應基因的表達以調節開花時間，避免在不適宜的環境開花而降低生殖成功率。植物開花是一個復雜的生理過程，是外界環境與內在因素相互作用的結果。Boss等[1]通過對模式植物擬南芥的研究，相繼提出了光周期途徑（Photoperiod pathway）、春化途徑（Vernilization pathway）、自主途徑（Autonomous pathway）和赤霉素途徑（GA pathway）調控開花。隨著研究的深入，在上述途徑的基礎上，Wang等[2]又提出了年齡途徑（Aging pathway）調控開花。

1.1 光周期途徑

光從光質、光強和光周期3個方面影響植物的形態建成、休眠、開花等多種生理過程。植物通過生物鐘感受光周期的變化，根據日照時長調節開花時間早晚，是光周期途徑的本質[3-4]。FLOWERING LOCUS T（FT）蛋白由FT基因編碼，是成花素（Florigen）的主要組分，在葉片中合成，通過篩管長距離運輸到頂端分生組織（Shoot apical meristem，SAM）誘導花芽分化[5]，可以通過整合光周期、春化、自主途徑和年齡通路信息調控開花[6-8]。擬南芥中，核因子Nuclear Factor Y（NF-Y）結合FT啟動子區的CCAAT框（CCAAT-box）形成復合體，CONSTANS（CO）識別該復合體以促進FT的轉錄，進而調控植物開花[9-11]。CO蛋白在白天穩定，黑暗時會被蛋白酶降解[3,12]。同時CO基因的表達還受生理節律影響。白天，植物生物鐘調節途徑通過接收光信號，影響GIGANTEA（GI）的表達。GI可以與Flavin-binding kelch-repeat F-box protein 1（FKF1）形成復合體，泛素化降解CO表達抑制因子 CYCLING DOF FACTORS（CDFs），恢復CO的轉錄水平[13-15]。MicroRNA（miRNAs）同樣能夠調控植物成花。受 GI調控的 MicroRNA172（miR172）通過非 CO途徑作用于FT，從而調控植物成花[16]。茶樹中已克隆到FT的2個轉錄本，分別是CsFTa和CsFTb，2個轉錄本僅有1個堿基差異。通過楊樹表達進行功能驗證，結果表明CsFTa具有顯著的促進開花功能，而CsFTb雖未表現出早花表型，但可以顯著抑制短日照誘導的休眠芽的形成[17]。該結果表明茶樹CsFT基因具有調節開花和生長的雙重功能。根據茶樹最新的基因組測序結果[18]，茶樹中注釋到CO基因24條，GI基因3條，FKF1基因1條，CDF1基因8條，核轉錄因子NF-YC9B基因1條，未注釋到DNF基因。山茶花（Camellia japonica）是一種與茶樹親緣關系較近的觀花苗木，屬長日照植物。研究表明，長日照可提前山茶花的花期[19]。迄今為止，尚未有揭示光周期調控茶樹開花機制的研究報道。

1.2 春化途徑和自主途徑

溫度是重要的環境因素，影響植物生長發育的方方面面。生長在溫帶地區的種子植物，需通過冬季一段時間的低溫才能夠開花的現象叫做春化。自主途徑是植物生長到一定程度，即使未經歷春化，最終也能調控植物開花的途徑。春化途徑和自主途徑都是通過 RNA加工和表觀遺傳等方式調控 FLOWERING LOCUS C（FLC）基因的表達以調節成花的[20-21]。研究表明，春化作用使得FLC的轉錄水平下降，FLC的轉錄水平反映春化反應的程度。在低溫處理后，VERNALIZATION（VRN）繼續維持FLC轉錄的低水平，是細胞記憶春化的一種機制。VRN蛋白包含 DNA結合蛋白VRN1、多梳家族蛋白 VRN2和 PHD鋅指蛋白VIN3[22-25]。根據茶樹最新的基因組測序結果[18]，茶樹中有FLC基因1條，VRN2-like基因2條。北方桃樹、李樹等開花植物需要經歷一定時期的低溫才能滿足其花芽分化和打破芽休眠所需的冷量[26-27]。茶樹冬季存在芽休眠過程，但是其花芽分化是否需要低溫誘導還有待進一步研究。

自主途徑是主要通過 FCA、FY、FPA、FVE、FLOWERING LOCUS D（FLD）、LUMINIDEPENDENS（LD）和 FLOWERING LATE KH MOTIF（FLK）抑制FLC的表達促進開花[28]。FCA和FPA協同抑制FLC基因座遠端的多聚腺苷酸反義RNA的表達[29-31]。FY通過去除H3K4甲基化抑制FLC的表達[32]。FVE和FLD則通過去除組蛋白乙酰化，抑制FLC的表達[33-34]。擬南芥ld和flk單突變體無論在長日照還是短日照條件下都具有晚花表型，突變體中FLC表達均上調[35-38]，但具體作用原理還不清楚。根據最新的茶樹基因組測序結果[18]，茶樹中FCA基因有2條，FPA-like基因有3條，FLD基因1條，FLK基因5條。截至目前，茶樹中自主途徑調控開花的研究未見報道。

1.3 赤霉素途徑

赤霉素（Gibberellin，GA）在被子植物成花調控中具有重要作用。不同種類的GA對植物的影響也不盡相同[39]，研究表明 GA3抑制蘋果成花，而 GA4則促進成花。在多年生木本植物中，GA3大多抑制成花。在柑橘中，GA3起抑制成花的作用，而花芽分化過程中，核酸和蛋白含量上升，推測兩者通過抑制GA合成或抑制其作用以促進成花[40]。黃亞輝等[41]通過使用不同激素噴施龍井43群體種發現，單獨噴施 GA3或 GA3配合 IAA或萘乙酸（NAA）使用時能抑制著花數量提高茶葉產量，說明 GA3具有抑制茶樹成花的作用，這與在柑橘和蘋果中的研究結果一致。GA與其受體蛋白GID1結合發揮作用，而DELLA蛋白則抑制GA的作用。茶樹基因組中有GID1基因 39條[18]，目前茶樹中已經克隆到 1個GA受體基因CsGID1a，屬于激素敏感性脂肪酶（HSL）家族，高濃度GA3能夠下調CsGID1a的表達[42]，由于 GA3抑制成花，推測該基因具有促進成花的作用。Repressor of GA1-3（RGA），Gibberellin Insensitive（GAI），RGL1（RGA-like 1），RGL2和RGL3編碼的蛋白均屬于DELLA蛋白，DELLA蛋白通過消除GA效應調控植物生長，在調控植物開花方面具有重要作用[43-44]。根據基因組注釋結果，茶樹中有GAI基因 66條，RGL1基因 14條，RGL2基因24條，RGL3基因1條，未注釋到RGA基因[18]。迄今為止，GA影響茶樹成花的研究僅停留在觀察統計層面，其中的作用機理尚不清楚，有待進一步研究。

1.4 年齡途徑

為擺脫成花對環境的依賴，多年生植物進化出了年齡途徑，在營養貯備不足及發育不成熟的幼年期抑制生殖生長，發育成熟后才具備生殖能力。MicroRNA156（miR156）是至今唯一已知的年齡分子標記，介導植物從幼年期向成熟期的轉變過程。隨著年齡的增長，miR156表達水平逐漸降低[45]。最新研究表明miR156主要通過介導 SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE（SPL）轉錄后調控來影響植物開花[46]。SPL基因家族編碼植物特異的轉錄因子，參與植物階段轉變、開花時間調控、果實發育、分枝、萌葉率、赤霉素信號轉導、對銅和真菌毒素的反應等眾多生長發育過程[47-48]。擬南芥中SPL促進營養期向生殖期的轉變，幼年期高含量的miR156與SPL mRNA的3′非翻譯區靶位點結合，抑制SPL的轉錄；而成熟期miR156含量降低，SPL3或許包括SPL4和SPL5的表達量增加促進成花轉變[49]。SPL3直接與FT基因啟動子區的GTAC模體結合，上調FT基因的表達，進而促進成花[8]。然而擬南芥是一年生被子植物，在研究年齡途徑調控成花中不具有廣泛代表性。近日，Wei等[50]以多年生短日照植物菊花（Chrysanthemum morifolium）為研究對象，沉默CmNF-YB8基因導致菊花早熟，SPL3，SPL5和SPL9基因上調表達，而miR156下調表達，說明NF-YB8是miR156調控SPL表達的中間作用因子。茶樹CsSPL6和CsSPL9已被克隆，qRT-PCR結果表明茶樹SPLs基因受miR156負調控[51]，此結果與其他植物中的研究結果一致。此外，MADS-box基因家族基因SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1/AGAMOUS LIKE 20（SOC1/AGL20）也部分參與年齡途徑，調控分生組織部分細胞向花芽原基轉變[52-56]。

1.5 其他因素

通常植物在脅迫的環境下會加速生殖生長，通過產生更多種子等繁殖體來應對環境威脅。Lee等[57]觀察發現腺牧豆樹干旱年份的豆莢產量是濕潤年份產量的3.3倍，而花序長度與干旱脅迫呈負相關。在茶樹生產中，同樣是水分充足的年份開花少，而干旱的年份開花結實較多。番茄（Lycopersicon esculentumMill）中SlCDF3響應滲透、鹽、高溫和低溫等環境脅迫，通過調控CO和FT的表達來調節開花[58]。但環境中的脅迫因素，影響茶樹開花的分子機制尚不清楚。施肥是茶樹生產中重要的技術環節之一，施肥的種類和用量是影響樹體生長的重要因素。氮磷鉀肥是農業生產中最常用的肥料，在茶樹生產中，單施氮肥促進營養生長，提高產量，而單施磷肥促進生殖生長，花果量增多。Kai等[59]供給茶樹不同形態氮，發現施用銨態氮（NH4+）誘導miR156的表達，施用硝態氮（NO3-）則具有相反的作用。而高水平的miR156抑制開花，由此推測NO3-的施用有促進茶樹開花的作用，而施用 NH4+則抑制開花。王常紅等[60]研究發現，稀土促進IAA，GA等生長類激素向生長旺盛的組織和器官分布，從而促進其生長，故在花芽分化前施用促進新梢生長，而在花芽分化期則促進花的發育。生產中還發現茶園在春茶過后進行一定程度的修剪可以一定程度上減少開花結實量。深入揭示水肥、修剪等農藝措施影響茶樹開花的內在機理，對于有效控制茶樹產花數量，提高茶葉產量和品質有著重要意義。

2 花芽分化與花器官發育機制

茶樹開花周期長，花芽形成不同步，同一時間里可以觀察到盛開的花和處于不同分化階段的花芽。現階段認為，茶樹花芽分化分為前分化期，萼片形成期，花瓣形成期，雌、雄蕊原基形成期、子房、花藥形成期和雌、雄蕊成熟期等6個時期[61]。

2.1 花芽分化過程

植物的花芽分化一般具有生理分化和形態分化2個過程。生理分化為花芽分化提供生理環境和物質基礎。Jia等[62]報道了茶樹成花階段涉及的代謝通路，如類黃酮途徑、能量途徑、糖代謝和莽草酸途徑。通過對茶樹花蕾、半開的花和全開的花進行轉錄組測序，提取到的差異基因富集到次生代謝物生物合成通路和植物激素信號轉導通路，證明次生代謝物和植物激素在花芽分化過程中具有重要作用[63]，具體調控機制需要進一步挖掘。形態學觀察能確定花芽分化及發育的關鍵時期，同時為茶樹成花機制研究提供形態學依據，具有重要意義。江昌俊[64]制作并觀察了茶樹花芽的石蠟切片，研究認為茶樹花芽分化從6月中旬開始到6月下旬結束約20 d，并將茶樹花芽分化分為分化初期、萼片形成期、花瓣形成期及雄蕊和雌蕊形成期4個時期。萼片形成期的特點是生長錐分裂，出現萼片突起；花瓣形成期的特點是生長錐分化出幾輪花瓣；雄蕊和雌蕊形成期的特點是生長錐頂端出現少量雄蕊突起和一個較大雌蕊突起。嚴學成[65]對茶樹形態結構進行了較全面系統的觀察，認為茶樹花芽分化分為前分化期，萼片形成期，花瓣形成期，雌、雄蕊原基形成期、子房、花藥形成期和雌、雄蕊成熟期等6個時期，并得到廣泛認可。

目前，對花芽分化的組織形態學研究多以石蠟切片觀察為主要手段，但石蠟切片觀察僅能觀測到花芽形態學分化起始之后的變化，并不能用于研究花芽生理分化時期。處于花芽生理分化時期的植物的芽葉中基因表達和代謝活動都較為劇烈，但形態上并沒有明顯變化，因此，要更加完整的研究茶樹花芽分化過程，需要借助更多技術手段，如：實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、原位雜交、蛋白雜交（Western-blot）、質譜技術、轉錄組學和代謝組學等來檢測形態分化時期之前，芽葉內基因轉錄與翻譯水平和代謝水平的動態變化。

2.2 花芽分化與花發育分子基礎

SAM 向花序分生組織（Inflorescence meristem，IM）的轉變是營養生長向生殖生長轉變的開端，IM 分化出花分生組織（Floral meristem，FM）是花芽形成的基礎。TERMINAL FLOWER1（TFL1）基因是 IM特異基因，起到形成和維持 IM 的作用，TFL1與FM決定基因LEAFY（LFY）和APETALA1（AP1）相互作用，抑制IM向FM的轉變[66]。基于現階段的研究，茶樹中有TFL1基因1條[67]。擬南芥的 FM 中，4個 MADS-box基因SOC1，SVP，AGAMOUS-LIKE 24（AGL24）和SEPALLATA 4（SEP4）直接抑制TFL1，同時伴隨TFL1基因座染色體構象改變；在水稻中，這 4個 MADS-box基因的同源基因通過調控TFL1-like基因決定圓錐花序的分枝[68]。擬南芥AP1基因既能參與 FM分化，又能作為花器官發育 A類基因決定外兩輪花器萼片和花瓣形態建成。茶樹已經克隆到AP1基因，在分化初期的花芽、萼片和花瓣中表達量很高[69]，推測茶樹AP1基因功能與擬南芥的相似。

基于對模式植物擬南芥的研究，Coen等[70]最早提出花器官發育的“ABC”模型，只有3類基因都在的情況下才能發育出正常的花；后來Colombo等[71]發現調控胚珠發育的D類基因，Rounsley等[72]協調表達A、B、C類基因，并不能使營養器官轉變成花器官，推測還需要有另外的基因參與調節花器官的發育；Pelaz等[73]用SEP3與A、B類或B、C類基因共同轉化擬南芥，營養器官能轉變為花器官，至此花發育模型修正為“ABCDE”模型（圖1）。

圖1. 花器官發育的ABCDE模型[74]Fig. 1 The ABCDE model of floral organ development

茶樹中已克隆的開花相關基因見表1。目前茶樹開花基因研究主要集中在花發育相關基因上，其中參與調控成花時間的基因有開花整合子FT，細胞色素P450，編碼赤霉素結合蛋白基因GID1a，年齡途徑中的SPL6和SPL9；花分生組織基因AP1、LFY、WUS2、WUS8、KNOX，其余基因都是花器官發育相關基因。

表1 茶樹開花相關基因Table 1 Flowering-related genes in tea plant

3 展望

茶樹是葉用經濟作物，茶樹芽葉的數量和質量直接影響茶葉的產量和品質。開花和結實都是大量消耗樹體養分的生理過程，嚴重影響茶樹的營養生長以及茶葉的產量和質量。因此，解析茶樹花芽分化的調控機制及其影響因素，對于茶葉生產而言具有非常重要的意義。

目前，茶樹成花相關研究尤其是機理研究基礎相對薄弱。今后，要借鑒其他植物特別是木本植物的最新研究進展，重點從以下幾個方面開展研究，以解析茶樹花芽分化、發育等的機制以及影響因素，為調控茶樹花芽分化、提高茶葉產量和品質等提供有效的技術手段。

（1）利用組織切片染色觀察、原位雜交等試驗手段準確鑒定茶樹花芽分化的時間及花芽發育過程，結合多組學分析檢測不同花芽分化階段所伴隨的核酸、蛋白及代謝物的變化，確定茶樹花芽生理分化關鍵時期和影響花芽分化的重要調控因子。

（2）研究不同環境條件（如長日照、短日照、低溫、干旱等）、營養條件（如不同種類、用量的肥料）和外源處理（如噴施不同種類植物激素及其抑制劑）對茶樹成花表型的影響，通過基因表達分析和功能驗證深入探究環境因素及內源激素對茶樹開花的影響。

（3）重點通過對比各樹齡茶樹在轉錄、翻譯及代謝水平上的差異，明確茶樹幼年期向成年期轉變的分子生理變化，深入研究關鍵性調控因子，揭示年齡途徑影響開花的機制。

（4）將傳統雜交育種與分子設計育種相結合，培育出不同開花特性的茶樹品種，如多花品種、無花品種和雄性不育品種。為解決生產中茶樹的資源利用、營養高效和提高雜交育種效率提供豐富的種質資源和育種材料。