紅茶及其發花紅磚茶對高尿酸血癥模型小鼠的降尿酸作用

袁冬寅，肖文軍,3，彭影琦，林玲，周陽，譚春波，譚洪波，龔志華*

1. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 湖南武陵秀峰茶業有限公司，湖南 常德 415000；3. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128

高尿酸血癥（hyperuricemic,HUA）是由嘌呤代謝絮亂導致機體尿酸水平超出正常范圍的一種生理現象[1]。機體內尿酸生成增多和/或排泄減少是導致HUA的主要原因[2]，降低尿酸代謝過程中的關鍵酶活性是防治HUA重要的切入點。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase,XOD）和腺苷脫氨酶（adenosine deaminase,ADA）是尿酸合成過程中的關鍵酶，可通過抑制其活性來降低體內尿酸水平并達到緩解HUA的效果[3]。研究表明，HUA不僅是痛風的并發癥，而且還會引發高血壓、冠心病、糖尿病等[1,4]。

紅茶是六大茶類中的全發酵茶，含有茶黃素、茶紅素等品質和功能成分，具有治療心腦血管疾病、降脂減肥、預防神經退行性疾病等[5-9]的多種生物活性作用。朱創等[6]研究表明，紅茶提取物能抑制肝臟XOD活性，減少尿酸生產。隨著近年對茯磚茶在減肥、降血脂、抗氧化、抗腹瀉、保肝護肝等健康功能方面研究的深入[10-14]，在發現普洱熟茶具有降低高尿酸模型小鼠尿酸的作用之后，又發現金花散茶也能通過抑制肝臟XOD、ADA活性而減輕HUA的癥狀[15-16]。發花紅磚茶是在紅茶的基礎上增加了發花、壓制等工藝的一種紅茶新產品，是否比其紅茶具有更好的降尿酸作用尚有待進一步探究。本研究以相同鮮葉加工而成的紅茶及其發花紅磚茶為原料，以高尿酸血癥小鼠作為試驗對象，探究發花紅磚茶是否具有降尿酸作用，比較紅茶及其發花紅磚茶的降尿酸效果，為發花紅磚茶的生產與消費提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設備

1.1.1 試驗動物

SPF級KM小鼠90只，雄性，(20±2)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，試驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.2 材料

紅茶及發花紅磚茶均由湖南武陵秀峰茶業有限公司生產加工。紅茶是由碧香早一芽三四葉經萎凋、揉捻、發酵、干燥等工藝加工而成；發花紅磚茶是在紅茶的基礎增加了發花、壓制等工藝加工而成。

1.1.3 試劑

氧嗪酸鉀（PO）購于上海阿拉丁，純度≥98%；別嘌呤醇片購于上海信誼萬象藥業股份有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購于國藥集團化學試劑有限公司；尿酸、尿素氮、肌酐、XOD、ADA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.4 儀器設備

多功能酶標儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司）、MIKRO22R 型臺式冷凍離心機（德國 Hettich 公司）、電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）、冷凍干燥機（廣州三元科技有限公司）、PowerGen 125高速勻漿機（中國賽默飛世爾科技公司）、旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、紫外分光光度計UV-2550（日本島津公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樣前處理方法

稱取加工原料嫩度一致的紅茶和發花紅磚茶各600 g，分別粉碎后，按茶水比1∶10在沸水浴中提取 30 min，浸提 2次，過濾，合并濾液于55℃下旋轉蒸發儀濃縮至固態物含量約30%后，冷凍干燥分別得干粉143.50 g與 147.70 g，鋁箔袋收集干粉，放入冰箱保存。經檢測，紅茶干粉中茶多酚、咖啡堿、簡單兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量、茶黃素、茶紅素、茶褐素含量分別為31.30%、10.24%、1.30%、1.69%、3.29%、1.55%、19.61%、22.67%。發花紅磚茶干粉中茶多酚、咖啡堿、簡單兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量、茶黃素、茶紅素、茶褐素的含量分別為30.90%、11.44%、1.61%、1.19%、2.80%、1.22%、19.18%、29.70%。

1.2.2 HUA小鼠模型的方法建立

20只SPF級KM小鼠適應性飼養7 d后，稱重，隨機分為正常組（NC）、模型組（MC），每組10只。第8天上午，模型組灌喂250 mg·kg-1的PO（用0.50% CMC-Na溶液懸?。┻M行造模[15]，灌喂體積為每 10 g體質量 0.1mL，正常組灌喂等體積的0.50% CMC-Na溶液，連續7 d，并在第14天灌喂處理1 h后，2組小鼠注射2%戊巴比妥鈉麻醉，摘眼球取血，每組采血時間不超過5 min。血液室溫靜置、離心取血清檢測血尿酸（SUA）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）。根據文獻[6]，當模型組SUA水平顯著高于空白組時，說明造模成功，當BUN和/或SCr水平顯著高于空白組時，說明PO可能對腎臟造成損傷，并由此來建立HUA小鼠模型的方法。

1.2.3 動物試驗設計

以建立的HUA小鼠模型方法為基礎，將90只 SPF級 KM小鼠在 22～25℃條件下適應性飼養 7 d后，稱體質量，隨機分為正常組（NC）、模型組（MC）、紅茶高劑量組（BH）、紅茶中劑量組（BM）、紅茶低劑量組（BL）、發花紅磚茶高劑量組（FBH）、發花紅磚茶中劑量組（FBM）、發花紅磚茶低劑量組（FBL）、別嘌呤醇組（AP），每組10只。按參考文獻[15,17]，確定別嘌呤醇劑量為 20 mg·kg-1·d-1，按1.2.1處理所得的茶粉高、中、低劑量分別為 2 g·kg-1·d-1、1 g·kg-1·d-1、0.50 g·kg-1·d-1。第8天至第14天期間，除正常組之外，其余各組按1.2.2所述方法每天定時灌喂PO進行造模，同時正常組灌喂等體積的 0.50%CMC-Na溶液。第15天至第28天期間，在正常組與其余各組分別灌喂等體積的 0.50%CMC-Na和PO 1 h后，別嘌呤醇組與給茶組分別灌喂相應劑量的別嘌呤醇和茶水提取物（均溶解于6 mL水中），正常組與模型組均灌喂等體積的水，灌喂體積為每 10 g體質量0.1 mL；第26天，用代謝籠收集24 h的尿液；第28天，各組灌喂給藥1 h后，每只小鼠注射2%戊巴比妥鈉麻醉，摘眼球取血，每組采血時間不超過5 min，并解剖肝臟、腎臟組織。

1.3 檢測方法

1.3.1 小鼠體質量與器官指數測定

每天稱每組小鼠總體質量，隔日稱每只小鼠體質量。

將小鼠肝臟與腎臟于 4℃的生理鹽水洗凈血漬，濾紙吸干表面水分后稱其濕重。

器官指數（%）=器官質量（g）/小鼠體質量（g）×100%。

1.3.2 血尿酸、血尿素氮、血肌酐含量測定

采血后室溫靜置1 h，4℃下3 000 r·min-1離心 10 min，取血清，按試劑盒測定 SUA、BUN、SCr含量。

1.3.3 尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐含量測定

新鮮尿液以 3 000 r·min-1離心 15 min，去沉渣，取上清液，按試劑盒測定UUA、UUN、UCr含量。

1.3.4 肝臟組織中XOD和ADA活性測定

將肝臟組織按質量（g）在預冷的生理鹽水體積（mL）為1∶9比例下，在冰水浴中混合，再用組織勻漿機制成 10%勻漿，2 500 r·min-1離心10 min，小心除去脂質層，取上清液按試劑盒測定XOD及ADA活性。

1.3.5 茶粉品質成分檢測

茶多酚總量的檢測采用 GB/T 8313—2008方法；咖啡堿、兒茶素的含量檢測采用HPLC法[15]；茶黃素、茶紅素、茶褐素的含量檢測采用紫外比色法[18]。

1.4 數據處理

試驗數據以平均值±標準差（±s）表示，采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行分析；二組間的差異采用t檢測，多組間比較用單因素方差分析，考察各組間的統計學差異；P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 HUA小鼠模型方法的建立

血肌酐水平是評價機體腎功能的重要指標，腎功能損傷導致肌酐排泄障礙，從而引起機體肌酐水平的升高。表1表明，與正常組相比，小鼠連續7 d灌喂250 mg·kg-1PO進行造模后，盡管模型組與正常組的BUN水平無顯著性差異（P＞0.05），但 SUA、SCr水平顯著升高（P＜0.05），其中SUA比正常組升高了52.30%，說明造模成功。

2.2 紅茶及其發花紅磚茶對 HUA模型小鼠的降尿酸作用

2.2.1 對體質量與器官指數的影響

由表 2可知，整個試驗過程中，各組小鼠體質量均有所增加。正常組與模型組相比，體質量增加量無顯著差異，說明灌喂 PO未對體質量造成影響。8～20 d給藥期間，與模型組相比，給茶組體質量均顯著降低（P＜0.05），這可能與紅茶、發花紅磚茶具有降脂減肥作用有關。

表3顯示，與正常組相比，模型組肝臟、腎臟指數均有所上升，其中肝臟指數達顯著水平（P＜0.05）。與模型組相比，給茶組肝臟、腎臟指數均降低，其中除紅茶低劑量組之外，其他給茶組的腎臟指數達顯著水平（P＜0.05），同時兩種茶對應劑量組之間均無顯著差異。與別嘌呤醇組相比，除紅茶低劑量組之外，其他給茶組的腎臟指數均顯著降低（P＜0.05）。說明紅茶及其發花紅磚茶具有降低HUA小鼠肝臟、腎臟指數的作用。

2.2.2 對小鼠血尿酸、血尿素氮和血肌酐的影響

圖1表明，與正常組相比，模型組小鼠的SUA、BUN、SCr水平均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，別嘌呤醇組的 SUA、BUN、SCr水平顯著降低（P＜0.05），其中SUA、SCr達極顯著水平（P＜0.01）。灌喂二種茶均能降低HUA小鼠SUA、BUN、SCr水平，其中，發花紅磚茶中、高劑量組在降低 SUA的效果上比紅茶更好。與模型組相比，紅茶低、中、高劑量組的SUA水平分別降低13.69%、16.58%、17.92%（P＜0.05），發花紅磚茶低、中、高劑量組的SUA水平分別降低14.67%（P＜0.05）、24.44%（P＜0.01）、26.43%（P＜0.01）；同時二種茶均能極顯著降低 BUN、SCr水平（P＜0.01），且均優于別嘌呤醇組；發花紅磚茶低劑量組在降低BUN的效果上比紅茶更好，而二種茶在降低SCr方面則無顯著差異。由此提示紅茶和發花紅磚茶均具有保護HUA小鼠腎臟的作用。

表1 灌喂氧嗪酸鉀對小鼠SUA、BUN及SCr水平的影響Table 1 Effects of potassium oxonate on serum uric acid,BUN and serum creatinine levels in mice

表2 紅茶及其發花紅磚茶對HUA小鼠體質量的影響Table 2 Effects of black tea and its flower brick tea on the weight changes of hyperuricemic mice

表3 紅茶及其發花紅磚茶對HUA小鼠器官指數的影響Table 3 Effects of black tea and its flower brick tea on organs index of hyperuricemic mice

2.2.3 對小鼠尿尿酸、尿尿素氮和尿肌酐的影響

從圖2可以看出，與正常組比較，模型組的 UUA、UUN、UCr水平均極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，別嘌呤醇組的UUA、UUN、UCr均極顯著升高（P＜0.01），紅茶及發花紅磚茶各劑量組的 UUA、UUN、UCr水平均不同程度升高，其中高劑量組的 UUA以及中、高劑量組的 UUN、UCr達極顯著水平（P＜0.01），此外，紅茶中劑量組的UUA以及低劑量組的UCr達顯著水平（P＜0.05），發花紅磚茶低劑量組的UCr達極顯著水平（P＜0.01）。與紅茶各劑量組相比，發花紅磚茶高劑量組在升高UUA、UUN、UCr的水平上以及中、低劑量組分別在升高UUN與UCr水平上優于紅茶。與別嘌呤醇組相比，二種茶中劑量組及發花紅磚茶高劑量組、二種茶高劑量組分別在升高 UUN、UCr水平方面作用效果優于別嘌呤醇組。

圖1 紅茶及其發花紅磚茶對HUA小鼠SUA、BUN和SCr水平的影響Fig. 1 Effects of black tea and its flower brick tea on serum uric acid,BUN,serum creatinine levels in hyperuricemic mice

2.2.4 對小鼠肝臟組織 XOD和 ADA活性的影響

圖 3表明，模型組小鼠肝臟組織中的XOD、ADA活性與正常組相比，均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，別嘌呤醇組的 XOD、ADA活性分別降低了 23.13%、18.96%，差異均達極顯著水平（P＜0.01）；紅茶及發花紅磚茶各劑量組的XOD、ADA活性均不同程度降低，其中，中、高劑量組達顯著水平（P＜0.05），發花紅磚茶高劑量及紅茶中、高劑量達極顯著水平（P＜0.01），同時二種茶對應劑量組之間無顯著差異。

圖2 紅茶及其發花紅磚茶對HUA小鼠尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐水平的影響Fig. 2 Effects of black tea and its flower brick tea on urine uric acid,urine urea nitrogen and urine creatinine levels in hyperuricemic mice

圖3 紅茶及其發花紅磚茶對HUA小鼠肝臟組織XOD和ADA活性的影響Fig. 3 Effects of black tea and its flower brick tea on XOD and ADA activities in hyperuricemic mice

3 結論與討論

尿酸是由嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶、XOD等作用下產生的代謝產物，大多可通過肝臟尿素酶作用降解為尿囊素隨尿液排出。正常情況下，機體中的尿酸生成與排泄基本保持動態平衡，但當血尿酸產生過多和（或）分泌過少均可引發高尿酸血癥[19-20]。PO是一種尿酸酶抑制劑，可特異性阻斷尿酸降解為尿囊素，從而提高血尿酸水平。因此，在高尿酸血癥的試驗研究中PO已被廣泛應用于高尿酸血癥的造模[16]。

試驗結果顯示，與模型組相比，紅茶及其發花紅磚茶各劑量組的體質量增加量、腎臟指數及SUA水平均顯著降低，UUA水平則不同程度升高，且對SUA、UUA的作用效果具有劑量效應；同時二種茶均能極顯著降低血清中尿素氮、肌酐水平，作用效果優于別嘌呤醇，還提高尿液中尿素氮、肌酐水平，說明紅茶及其發花紅磚茶均對腎臟具有保護作用。這可能與二種茶含有一定量的茶多酚、咖啡堿、茶黃素等活性較強的物質有關。有研究發現，茶多酚中EC、EGC、ECG對高尿酸血癥小鼠具有降尿酸作用，而 EGCG對高尿酸血癥小鼠無顯著降尿酸作用[21]。本試驗發現，與紅茶各劑量組相比，發花紅磚茶高劑量組在降低血尿酸、提高尿尿酸、尿尿素氮、尿肌酐水平等方面均優于紅茶。這可能是發花紅磚茶在發花工藝過程由于冠突散囊菌等微生物的參與而使像酯型兒茶素EGCG這類物質部分發生水解，轉變成簡單兒茶素和沒食子酸，為其降尿酸奠定了物質基礎[22]，也有可能是在后發酵過程中由兒茶素、茶黃素或茶紅素進一步氧化聚合所致。

XOD是尿酸生產過程中的關鍵酶，是抗高尿酸血癥藥的良好靶點，能催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸和超氧離子，XOD活性或濃度增加是尿酸生成增多的主要原因[2]。ADA在嘌呤代謝和腺苷平衡中起重要作用，能催化2-脫氧腺苷和腺苷水解脫氨，腺嘌呤核苷脫氨轉變為次黃嘌呤核苷，間接影響尿酸的生成[23]。PO誘導的 HUA小鼠會導致體內抗氧化能力明顯減弱，過高尿酸水平會造成細胞膜內外滲透壓不平衡，引起多種酶活性發生改變。本試驗發現，與模型組相比，給茶組均能不同程度降低XOD、ADA活性，減少尿酸的產生。有研究發現，酚類和黃酮類等物質能抑制XOD活性。因為這些活性物質含有酚羥基結構，具有較強的抗氧化、清除氧自由基的作用，而且茶多酚還能降低細胞質膜被氧化，保護組織免受過氧化的破壞。因此推測紅茶及其發花紅磚茶能抑制XOD活性與這二種茶含有一定量的酚類和黃酮類物質有關[15,21,24-25]。但是，目前對抑制ADA活性物質基礎的研究較少，還不能進一步解釋這二種抑制ADA活性的物質基礎。此外，本試驗發現與模型組相比，給茶組的體質量增加量均出現降低的現象。這可能與紅茶中咖啡堿、兒茶素及其氧化成分等物質具有降脂減肥功效有關。由于高尿酸血癥與其他代謝綜合征的相互關系，因此推測，這二種茶在降脂減肥的同時還會導致尿酸水平的降低。同時研究發現，紅茶、發花紅磚茶對肝臟組織中XOD、ADA活性的抑制水平與其降低血液、尿液中的尿酸水平并未表現出完全一致的對應關系，可能與尿酸的產生除受XOD、ADA影響外還受其他因素影響所致，或者是這二種茶還參與其他機制調控著尿酸水平，但其機制尚需進一步探究。