含半胱氨酸和組氨酸豐富域蛋白1的研究進展

曲光瑾，張鐵民，王宇虹，羅善順，張 婧，韓 輝※

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 a.老年病科 國家老年疾病臨床醫學研究中心， b.結直腸外科，哈爾濱 150001)

含半胱氨酸和組氨酸豐富域蛋白1(cysteine and histidine rich domains containing protein-1，CHP-1)又稱Morgana，是高度保守的蛋白質家族成員之一，對植物發育和抗病性起重要作用。動植物可能具有相似的發育和抗病機制，動物核苷酸結合寡聚化結構域蛋白結構上類似于植物抗病蛋白(R蛋白)的一個亞類，參與細胞內病原體的識別和炎癥反應的啟動。脊椎動物具有兩個半胱氨酸和組氨酸豐富域(cysteine and histidine rich domains，CHORD)包含蛋白，即CHP-1和Melusin，無脊椎動物僅有CHP-1。Melusin是心肌特異性整合素結合蛋白，參與心肌細胞的過度增長，而CHP-1可在所有組織和細胞中普遍表達。序列分析表明，脊椎動物CHP-1和無脊椎動物CHP-1是同源物，而 Melusin 可能起源于進化過程中的基因復制[1]。哺乳動物CHP-1蛋白與熱激蛋白(heat shock protein，HSP)90相互作用。CHP-1和HSP90的分子伴侶p23和S相激酶相關蛋白1的G2等位基因抑制因子(suppressor of the G2 allele of Skp 1，SGT1)有相似的結構序列，可能是HSP90的分子伴侶，廣泛存在于哺乳動物的各組織器官，對生物的正常發育起重要作用。CHORDC1基因缺失可導致不育或胚胎死亡。CHP-1蛋白可在細胞缺血應激過程中避免凋亡，起到保護細胞的作用，并與多種疾病的發生、發展密不可分。現就CHP-1的研究進展予以綜述。

1 CHP-1的發現

Shirasu等[2]報道了一類新的真核鋅結合蛋白，是一種多物種抗病性基因(Rar1基因)編碼的蛋白，不僅存在于大麥抗病信號轉導中，還是秀麗隱桿線蟲發育的必需蛋白，參與細胞內病原體的識別和炎癥反應的啟動[3]。Rar1基因對過氧化氫刺激的宿主細胞具有保護作用，可降低其死亡率，其編碼含有60個氨基酸的蛋白，包括兩個分子量為25 500的CHORD蛋白，即CHP-1和Melusin[4]。Melusin是一種與心肌肥厚機械負荷有關的肌肉特異性蛋白，與CHP-1有63%的同源性，廣泛分布于機體各種組織細胞[5]。沉默秀麗隱桿線蟲的CHORD-containing基因可導致半數秀麗隱桿線蟲不育[6]。CHP-1+/-小鼠并不表現發育異常或可見畸形[7]。雜交鼠胚胎形成3.5 d后，形態正常的CHP-1-/-胚胎以正常的孟德爾頻率出現，但此后未再檢測到CHP-1-/-胚胎，提示CHP-1基因在動物發育過程中起重要作用[8]。

2 CHP-1的結構

CHP-1具有兩個CHORD區域，N端由92個氨基酸序列間隔，C端Melusin含有30個酸性氨基酸殘基的鈣結合伸展結構；而CHP-1的C端由85個氨基酸組成，與SGT1有很大同源性[9]。SGT1是泛素連接機制和酵母動粒組裝途徑的重要組成部分，也是重要的植物抗病蛋白[10]。對小鼠和人類進行基因組序列分析的研究表明，CHP-1基因定位于小鼠第9號染色體，人類11q14.3染色體[11]。CHP-1和Melusin基因共享保守的外顯子和內含子，其基因編碼序列在小鼠和人類基因組中由11個編碼外顯子組成。小鼠和人類基因組的CHP-1編碼外顯子的分子量均為21.6 kb左右，前4個外顯子(1～4)編碼第一個CHORD結構域以及中間區域，而第二個CHORD完全由3個外顯子(6～8)編碼，SGT1樣結構域由3個末端編碼外顯子(9～11)編碼[11]。數據庫分析并驗證其他種屬CHP-1和Melusin同源性發現，真菌和斑馬魚CHORDC基因可編碼Melusin和CHP-1，但在果蠅和秀麗隱桿線蟲中只能編碼CHP-1，且果蠅和秀麗隱桿線蟲特有的CHORD蛋白與小鼠和人類CHP-1的同源性高于Melusin[12-13]。CHP-1是金屬結合蛋白，可以結合植物CHORD區域的鋅離子，并保留了調節哺乳動物CHORD區域鋅離子的能力。由于CHP-1不具有末端酸性結合域，因此不結合鈣離子[14]。

3 CHP-1的作用及機制

CHP-1是與系統發育相關的保守蛋白質，通過抑制ROCK激酶的活性調節中心體復制，廣泛存在于成體有絲分裂后的組織，除細胞分裂調節作用外，還對細胞應激起保護作用。CHP-1分子伴侶活性可能保護細胞應激損傷[15]。CHP-1的表達與HSP70類似，免疫印跡分析顯示，以43 ℃孵育NIH 3T3細胞 45 min，然后復溫至37 ℃，復溫后維持3 h，CHP-1信使RNA的轉錄增加3倍，同時蛋白水平升高；熱應激后8 h，轉錄水平回落至基線。NIH 3T3細胞轉染過表達CHP-1慢病毒，升溫或過氧化氫處理后，可避免細胞的致死性應激[16]。

短暫性腦缺血發作可使受損蛋白和多種HSP增加。缺血期3～5 d，海馬1區神經元的壞死顯著增加，海馬2～4區和齒狀回區神經元的壞死較少，表明后者具有內在保護機制。對沙鼠海馬1區、海馬2～4和齒狀回區CHP-1的表達水平進行測量發現，缺血3 h后，兩個部位CHP-1表達上升程度相似；缺血24 h后海馬1區CHP-1信使RNA表達水平恢復至基線，海馬2～4和齒狀回區的CHP-1信使RNA表達始終升高；且海馬缺血再灌注區HSP70的上調時間也較長，與CHP-1水平一致[17]。

CHP-1能夠結合和抑制ROCKⅠ和ROCKⅡ激酶的活性[18]。ROCKⅠ激酶在細胞凋亡中具有特異性作用，活性ROCKⅠ激酶過表達可誘導細胞膜起泡，細胞皺縮和核裂解，從而發生細胞凋亡。ROCKⅠ激酶還參與誘導上游的胱天蛋白酶3激活誘導的細胞凋亡，活性ROCKⅠ激酶突變體的表達足以誘導新生大鼠心肌細胞胱天蛋白酶3的裂解和激活。此外，ROCKⅠ激酶可磷酸化造血細胞和心肌細胞的第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)229和Thr321，提高PTEN的穩定性和活性。CHP-1可抑制ROCKⅠ激酶的活性，并高表達CHP-1，導致NIH 3T3細胞和乳腺癌細胞系的PTEN水平降低。CHP-1調節PTEN的能力取決于ROCKⅠ激酶，活性ROCKⅠ激酶可使PTEN的水平恢復正常，并增加過表達CHP-1細胞凋亡刺激的敏感性。PTEN是一種有效的腫瘤抑制劑，其缺失導致細胞自噬信號通路激活，PTEN的輕度下調對腫瘤的易感性和進展有強烈的影響，并可影響細胞存活和化療的耐藥性。三陰性乳腺癌PTEN呈低表達，故PTEN缺失可用于預測三陰性乳腺癌的早期復發。PTEN的表達和功能受不同機制(如基因突變、表觀遺傳沉默、微RNA調節、競爭性內源RNA、翻譯后修飾和定位改變癌細胞)的調節，通過翻譯后修飾破壞PTEN。CHP-1表達水平的增加可抑制ROCKⅠ激酶，導致PTEN不穩定，并提高化療藥物的耐藥性。與原發性腫瘤相比，卵巢癌化療后復發CHP-1的轉錄水平上調[19-20]。

CHP-1通過抑制ROCKⅡ激酶在中心體復制和基因組穩定性中起關鍵調控作用。中心體是大多數動物細胞的主要微管組織中心，包括一對中心粒，由中心粒外周物質包圍，形成組織微管，有助于細胞兩極形成紡錘體。正常細胞的中心體復制被嚴格調控，每個細胞周期僅發生一次。當調節機制失調時，同一細胞周期內中心體發生多次復制，導致具有多余中心體的細胞出現，此現象稱為中心體擴增[21]。具有多余中心體的細胞可形成異常紡錘體，無法介導染色體分離，導致出現非整倍體和多倍體細胞，促進腫瘤進展。CHP-1基因高度保守，在系統發育過程中起重要作用。果蠅神經母細胞中CHP-1的缺失導致強烈的有絲分裂表型，多倍體細胞頻繁出現，大多數二倍體細胞出現中心體擴增。CHP-1+/-胚胎來源的小鼠胚胎成纖維細胞的CHP-1單倍體缺陷，導致多倍體細胞、多中心體和多極紡錘體的高發。基因組不穩定性是癌細胞的典型特征，有利于癌癥的發生發展。與野生型小鼠相比，CHP-1+/-小鼠對化學誘變劑的敏感性顯著升高[4]。

4 CHP-1與HSP90的相互作用

對伴侶HSP90結構的研究表明，核苷酸和藥物配體可誘導幾種不同的構象狀態，但具體機制尚不清楚[22]。與其他HSP90共伴侶相似，CHP-1對熱變性檸檬酸合成酶具有自身的伴侶活性，此活性存在于CHP-1和SGT1的相似結構序列中。SGT1結構域與小型HSP的α-結晶結構域同源，可控制變性蛋白的聚集和分解。采用串聯質譜方法研究ATP、ADP和凝膠霉素對人HSP90相互作用體蛋白質組影響的研究發現了52種HSP90復合物的調節配體和分子伴侶；格爾德霉素處理后導致HSP90復合物顯著富集于CHP-1核心轉錄區，提示HSP90抑制可能在轉錄和CHP-1 RNA處理上具有共同的基礎作用，進一步證實了CHP-1是新的ADP依賴的HSP90相互作用蛋白；這種相互作用是由細胞裂解液中高AD∶ATP 比值以及體外純化的重組蛋白刺激和HSP90結合核苷酸的能力決定[23]。

HSP90相互作用體在核苷酸和藥物配體方面是動態的，且HSP90的藥理抑制可能刺激特異性復合物的形成。二聚體HSP90 ATP酶是一種高效的分子伴侶，在蛋白質折疊途徑的后期發揮作用，以協助折疊和激活特定蛋白質。HSP90在細胞分裂、代謝、信號轉導、轉錄和免疫等多種生物過程中發揮重要作用，是重要的抗癌靶點。HSP90復合物含有幾種分子伴侶和輔助蛋白，可調節ATP酶活性和輔助蛋白間相互作用[24]。在腎上腺皮質細胞系HEK293T中穩定表達N端及C端異常糖鏈糖蛋白標記的HSP90互補DNA，在5 mmol/L ATP、5 mmol/L ADP或5 mol/L格爾德霉素存在下對HSP90復合物進行異常糖鏈糖蛋白標記。HSP90復合物不能水解ATP，但能結合核苷酸的E47A突變體，其親和力與野生型HSP90蛋白相當。異常糖鏈糖蛋白標記突變體在體外可增強HSP90與底物肽之間的相互作用。有研究證明，酵母中與CHP-1類似的突變可加強酵母p23同源物Sba1p和酵母HSP90之間的相互作用，此相互作用受ATP的積極影響[25]。HSP90抑制劑治療后，HSP70表達顯著上調，由于參與應激反應的CHP-1亦在格爾德霉素依賴復合物中被鑒定出，故認為CHP-1可能同樣上調[26]。使用反轉錄聚合酶鏈反應確定依賴于格爾德霉素交互作用亞群的研究發現，經格爾德霉素處理后，HSP90復合物中蛋白質的增加與細胞豐度增加無關[27]。若HSP90和HSP70結合的相互作用發生在格爾德霉素處理后，則HSP70信使RNA表達的增加將直接反映在肽譜計數中。經格爾德霉素處理后，HSP70同源物HSPA8和HSPA1A的信使RNA豐度分別上調了2倍和18倍，而相應蛋白質光譜豐度的差異無統計學意義[28]。通過D93N可確定HSP90復合物依賴活性HSP90 ATP酶或HSP90結合核苷酸或凝膠霉素的能力。D93N突變阻止了HSP90 ATP酶活性位點的核苷酸結合，并基于D93N的類似機制與格爾德霉素和腺嘌呤核苷酸的接觸預測D93N突變對明膠霉素結合的干擾。可見，CHP-1依賴格爾德霉素與HSP90復合物成員的相互作用將顯著受損。

5 CHP-1在臨床中的應用

CHP-1減少可使細胞發生癌變，增強腫瘤易感性。在乳腺癌和肺癌中，CHP-1表達降低[乳腺癌67.3%(37/55)，肺癌57.7%(45/78)]，但可在少數乳腺癌(5.4%)和肺癌(10.3%)中過表達，特別是三陰性乳腺癌[4]。CHP-1過表達可能是某些腫瘤抑制中心體擴增實現遺傳穩定的機制之一，反映了基因的趨同現象，可抵消晚期腫瘤細胞的遺傳不穩定性，允許具有染色體組成的細胞克隆性擴增，從而賦予增殖優勢，其過表達與腫瘤分級、有絲分裂數和淋巴結陽性相關。因此，在低表達CHP-1的T47D和MDA-MB-231乳腺癌細胞中，上調CHP-1可增強化療藥物表柔比星和多西紫杉醇的敏感性。

CHP-1+/-小鼠可自發進展為一種類似于人類非典型慢性髓性白血病的致命性骨髓增生性疾病。對自發腫瘤形成CHP-1+/-小鼠的敏感性監測20個月發現，第12個月開始，60%的CHP-1+/-小鼠出現明顯的病理體征，如消瘦、脊柱變形和嚴重制動等衰弱癥狀；壞死鏡檢查未發現實體瘤；組織病理分析顯示，髓樣細胞浸潤于心肌、腦組織、腎臟等[29]。CHP-1缺失是ROCK激酶過度激活、中心體擴增和骨髓細胞遺傳學異常的重要因素。此外，CHP-1在以非復發性細胞遺傳學異常為特征的非典型慢性粒細胞白血病骨髓以及由BCR-ABL癌基因引起的部分費城染色體陽性慢性粒細胞白血病(Ph1 CML)骨髓中均呈低表達，預示其對伊馬替尼(費城染色體陽性慢性粒細胞白血病的標準治療)的反應更差[30]。

CHP-1作為腫瘤抑制劑的方式多樣，CHP-1低表達可誘導中心體擴增和細胞遺傳學異常；在費城染色體陽性慢性粒細胞白血病中，CHP-1與BCR-ABL信號協同作用，可降低伊馬替尼的治療效果，但低表達CHP-1患者骨髓中的ROCK抑制劑可恢復伊馬替尼誘導細胞凋亡的能力，表明ROCK抑制劑聯合伊馬替尼治療可以克服低表達CHP-1患者的耐藥性[31]。

此外，miR-26b可通過靶向CHP-1蛋白抑制乙型肝炎病毒的轉錄和復制[32]。CHP-1蛋白(而非CHP-1信使RNA)與miR-26b的 3′非翻譯區信使RNA互補，降低miR-26b的過表達。乙型肝炎病毒感染可抑制肝細胞miR-26b的表達，增加CHP-1蛋白的表達。C型尼曼匹克病多見兒童,患兒出生后發育多正常，少數有早期黃疸，常以肝脾腫大為首發表現，多在5～7歲出現神經系統癥狀，表現為智力減退、語言障礙、學習困難、感情易變、步態不穩、共濟失調、震顫、肌張力及腱反射亢進、驚厥、癡呆、眼底可見櫻桃紅斑或核上性垂直性眼肌癱瘓，患者CHP-1蛋白低表達可能與I1061T突變相關[33]。

6 小 結

CHP-1是系統發育相關的保守蛋白質，人體各器官均有表達，是一種具有調節鋅離子能力的金屬蛋白，可通過抑制ROCK激酶活性調節中心體的復制，活化HSP90的分子伴侶活性的作用，保護細胞免受致死性應激損傷。CHP-1在乳腺癌、肺癌、非典型慢性粒細胞白血病、乙型肝炎和C型尼曼匹克病均有異常表達，并與腫瘤的發生發展和耐藥密切相關，但目前仍主要集中于動物實驗研究階段，尚缺乏相關臨床試驗研究證據的支持，期待其成為未來抑制腫瘤的新靶點。