牙周炎動物模型的研究進展

孔 晨，李永麗，李思佳，孫慧穎，任紀巍，王 雷

(吉林大學口腔醫院牙周科， 長春 130021)

牙周炎是一種常見的牙齒周圍組織即牙齦、牙槽骨、牙周膜和牙骨質破壞的慢性感染性疾病，目前普遍認為菌斑微生物及其產物在局部的堆積和浸潤是牙周炎發生、發展的關鍵因子，而機體對此的應答反應則是決定牙周炎發生與否、發病速度、病變程度以及范圍的重要因素[1]。研究表明，牙周炎不僅導致牙齦出血、牙槽骨吸收、牙齒松動和脫落、牙周袋形成等局部病理變化，也與一些全身性疾病，如糖尿病、類風濕關節炎、心血管疾病、不良妊娠等密切相關[2]。近年來，隨著醫學知識的普及和人們對口腔健康重視程度的加深，牙周炎作為一項發病率極高且影響廣泛的口腔疾病，其防治工作迫在眉睫。建立正確合理的動物模型，有利于深入研究影響牙周炎發生發展的關鍵因素，為疾病的控制、藥物研發提供思路，從而開展積極有效的臨床防治工作。現就實驗動物的選擇、建模方法與機制，以及實驗中常見的影響因素予以綜述。

1 動物選擇

1.1靈長類 靈長類動物的口腔結構與人相似，其中猴與人的牙式相同，除尖牙較大，剩余牙齒的形態均與人牙相近，牙根形態及分叉情況也與人基本一致，因此建立的牙周炎模型與人相似度最高。靈長類動物具有天然存在的牙菌斑、牙結石和口腔微生物病原體，牙周炎易感性高，一般在選定臼齒周圍的鄰間區域的頂端放置牙菌斑積聚裝置如正畸彈性結扎絲，以促進斑塊形成、加速炎癥進程[3]。使用恒河猴建立牙周炎模型應用的最為廣泛，食蟹猴、獼猴、狒狒也有較多采用，但因屬于自然保護動物，購買途徑少且繁殖較慢，易感染結核，在大規模實驗研究中的應用受到較大的限制[4]。

1.2犬 犬的牙周組織結構以及牙周炎的病理學特點均與人相似，牙面常有牙石沉積，齦下菌斑的構成也與人類相似，其為研究自然發生的牙齦炎和牙周炎提供了合適的模型。Beagle犬作為牙周炎動物模型的造模動物被外國學者廣泛采用，1965年Egelberg[5]通過在Beagle犬牙頸部齦緣結扎并輔以牙周炎食譜成功建立了實驗性牙周炎模型。一般選擇全身發育良好，年齡1歲左右，體重12～15 kg的犬建立牙周炎模型。犬的患病率和病變程度隨年齡的增長而增加，不同品種之間差異明顯，這種在易感性和耐受性方面的差異來源于感染的性質和遺傳因素而非飲食[6]。另一方面，犬的攻擊性強、不易飼養、牙周病變程度和部位不均勻等特點也造成了該模型應用的局限性[7]。

1.3大鼠 大鼠每個象限有1個門齒和3個臼齒，一般通過在臼齒周圍的齦溝中放置結扎線或接種牙周病原體引起牙周病[8]。牙周炎模型構建時多采用2～4月齡的SD大鼠和Wistar大鼠，后者性情更為溫順。因大鼠繁殖率較高，飼養成本較低，因此有足夠的數量進行研究和統計分析，又因其生命周期短，適應能力及抗病能力強，可快速誘發疾病，是目前應用最廣泛的動物，尤其適用于測試各種藥劑緩解炎癥的功效[9]。但大鼠牙周病發病率遠低于人，且牙齒小，對操作和觀察有一定影響，同時因大鼠的牙齒能持續不斷的生長，只適合短時程的實驗研究。

1.4兔 兔口腔內存在多種病原微生物，菌群分布與致人牙周病的菌群相似，可較準確地模擬人類口腔疾病狀態[10]。除在牙齒周圍進行可重復的牙周炎癥研究外，兔的主要優點是單獨結扎不會引起軟組織或硬組織破壞。因此，與大鼠和小鼠相比，其可用于測試人類牙周病病原體的特定影響。結扎放置通過將共生菌群轉化為口腔致病菌群而誘導牙周病。目前兔較少用于構建牙周炎模型，主要用于測試生物材料或治療種植體周圍炎，兔也是測試骨愈合及其他非牙齒炎癥如心血管疾病的適用模型[11]。

1.5小型豬 自20世紀50年代以來，各種微型豬已廣泛用于生物醫學研究、人工器官研究以及作為皮膚傷口愈合模型。由于豬在大體解剖學和生理學上與人類相似，一些小型豬可通過類似的過程罹患人類疾病如糖尿病，與其他大型物種相比具有經濟優勢，是全身性疾病的優秀模型[12]。小型豬與人一樣有乳牙和恒牙，牙齒大小、牙周組織都與人相近。研究表明，6個月后的小型豬經常自發不同程度的牙齦炎，疾病進展模式與人類相同:牙齦腫脹，菌斑積聚，牙結石形成以及探診出血，并在組織學上伴有炎癥細胞浸潤和血管舒張，16個月時即可能發展為嚴重的牙周炎癥[13]。雖然目前因為價格、飼養問題而應用較少，但其有望成為自發性牙周炎的理想實驗模型。

1.6其他動物 小鼠和大鼠同屬于嚙齒動物，每個象限中有3個臼齒和1個無根切牙。由于小鼠牙齒細小，且每只只能提供微量的牙齦組織，因此實驗時需要擴大樣本量。年輕小鼠如果存在吞噬細胞遺傳缺陷，其控制原生菌的能力會受到影響，可能會發生由自身微生物群引起的牙周炎，是研究口腔病原微生物對牙周組織影響及宿主反應的優勢模型[14]。倉鼠的牙齒也與大鼠類似，牙周炎無自發性，頰囊內襯有復層鱗狀上皮，可用于口腔癌的研究[15]。羊具有自發性牙周炎的臨床特征和血清學特點，口腔微生物情況與人牙周炎極相似，但因其空間需求大、成本高、難控制，一般較少使用。雪貂會自然發生與人類相似的牙結石和牙周病，是研究牙結石的適宜模型，但其易從標準籠中脫出，需要特殊管理。

綜上，建立動物牙周炎模型時，大鼠、犬、小型豬以及猴的使用率最高，所選用的動物各有優缺點，其中大鼠以價格低廉、操作簡單、易于飼養、成活率高等優點而應用的最為廣泛。動物模型的構建基礎是選擇合適的實驗動物，所選動物應具備形體適宜、飼養方便等基本要求，并能較好地模擬人類牙周病的變化過程。

2 建模方法

2.1結扎線法 結扎線法誘導大鼠牙周骨丟失首次描述于1966年，目前單純利用該法構建動物牙周炎模型的技術已相當成熟，在各種牙周病的研究中均得到廣泛使用。常用的實驗動物是大鼠和小鼠，結扎材料有尼龍線、細絲線、橡皮圈、正畸用鋼絲等，一般結扎在實驗動物的牙頸部或齦溝內，主要通過結扎部位牙石和菌斑的積累刺激炎癥產生。此外，結扎時需要對牙頸部的牙齦組織進行輕度剝離，從而對牙齦牙周組織造成機械損傷，進一步導致牙周結締組織破壞和牙槽骨丟失，從而實現動物牙周炎模型的建立。

唐彩金等[16]采用10%的水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射對SD大鼠進行麻醉，然后用尖頭探針將第二磨牙的牙齦分離，用縫線在齦溝內結扎，15 d后進行組織學觀察，確定建模成功。崔迪等[17]用同樣的方法對9周齡的C57BL/6雄性小鼠的上頜第二磨牙進行結扎，28 d后牙槽骨吸收明顯。近年來大量研究顯示，采用單純結扎法通常在1～4周內實驗牙即出現明顯的牙齦紅腫、牙周袋形成、探診出血、菌斑堆積和牙槽骨吸收現象，且腭側結扎引起的骨丟失較頰側更為可靠[18-21]。此法不僅適用于大鼠，也基本適用于猴，但其建模周期更長。Kstopoulos和Karring[22]利用正畸用彈性橡皮圈結扎猴的上頜第一前磨牙、第一磨牙以及下頜側切牙的牙頸部，2～3個月后才有明顯的牙周組織破壞及牙槽骨喪失。目前，結扎線法因操作簡單、耗時較短而被廣泛采用，其中以正畸不銹鋼絲結扎的效果最好，成功率更高。在建模過程中要定期檢查結扎材料是否脫落，或根據需要進行更換。

2.2高糖黏性食料喂飼 調整動物飲食，制定特定的牙周炎食譜也是建立牙周炎模型的一種方法。一方面，黏性軟食在牙齒局部的黏附和嵌塞不利于牙的自潔，可加劇菌斑的附著和累積。另一方面，高糖飲食導致的糖尿病等疾病也對牙周炎有影響[23]。高血糖通過削弱牙齦的免疫力，一定程度上降低了牙周組織的抗感染能力，進而引發炎癥。高糖黏性食料喂飼最早由國外學者發現并驗證。采用高糖低蛋白飼料飼養時，實驗動物會有牙周袋產生、牙槽骨吸收和炎性細胞浸潤等病理變化，但單獨使用此法建模效果一般，且耗時較長。國外學者給予6周齡的雄性金黃地鼠高糖食譜(100 g食物含蔗糖56 g、全脂奶粉28 g、全麥粉6 g、酵母粉4 g、食鹽2 g、新鮮蔬菜4 g)，12周后才確定模型成功[24]。Zhu和Nikolajczyk[25]與Sarda等[26]探討糖尿病與牙周組織病變的聯系時，兩者的相互作用和影響也得到了證明。現階段，高糖黏性食料喂飼常與其他手段聯合使用，輔助誘導動物牙周炎的形成[27]，或用于伴糖尿病牙周炎動物模型的研究[28]，以更好地模擬臨床上相應患者的發病機制。

2.3接種細菌法 不良微生物及其產物的局部累積被普遍認為是牙周炎發生的始動因子，其通過直接破壞以及引發的宿主炎癥反應導致大部分組織破壞。牙周炎的發生發展并非傳統認為的是特定少數細菌導致的，而是不同細菌之間協同作用以增強對宿主防御的抵抗力、營養物攝取能力以及在炎癥環境中存在的持久力[29-30]。造成口腔微生物-宿主生態失衡的至關重要的低豐度細菌如伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等目前被稱為關鍵病原體，如牙齦卟啉單胞菌可以干擾宿主免疫力，并使異常生物群落出現，其也是目前建立動物牙周炎模型使用最為廣泛的菌種。一般為評估牙齦卟啉單胞菌在牙周組織中的侵襲性、評估特定牙齦卟啉單胞菌突變體定植以及引起骨丟失的能力多選擇靈長類動物、犬和小鼠模型[31]。

通過直接注射、局部涂抹或含菌食物嵌塞將致病菌接種至動物口腔均能誘導實驗動物產生牙周炎。研究表明，單一使用伴放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌都能建立小鼠牙周炎模型，且多種因素感染較一種因素感染引起的牙槽骨吸收更為嚴重[32-34]。也有學者指出，以注射或涂抹的方式接種細菌與牙周病發生的始動過程相悖；在食物中接種致病菌，進而使致病菌停留在口腔，這一過程與自然的病菌感染過程更為相似[35]。研究發現，革蘭陰性菌細胞壁外膜中的脂多糖具有強毒性和抗原性，易引發牙周炎，因此也可直接采用脂多糖誘導動物牙周炎產生[36]。甚至有研究認為，定位注射細菌脂多糖可能是一種更直接和受控制建立牙周病模型的方法，因為該疾病是由已知的牙周病病原體誘導的，感染時間準確，且對病原性刺激有更大的可控性[37-38]。

2.4植入牙石法 在一項針對牙周病患者的長期調查中發現，牙石在引起成人牙周病的因素中排名第2，僅次于菌斑，提示利用牙結石誘發牙周炎癥的可能性[39]。牙結石對牙周組織持續刺激，導致炎癥反復發作，同時牙結石壓迫牙齦，影響血液循環，造成牙周組織病菌感染，引發牙齦炎癥及萎縮，形成牙周袋，導致食物殘渣、菌斑和牙石等更易堆積，從而形成惡性循環。該方法雖然已在部分實驗動物如兔、大鼠中得到了驗證，但目前根據該方法建立牙周炎模型的研究少見，可能與其可控性小、病程與人自然發病過程相悖等有關。

2.5注射激素法 有觀點認為，糖皮質激素長期高水平導致的糖皮質激素受體過度激活可能會改變免疫系統反應，提高牙周炎的易感性[40]，但目前尚無定論。周秀青等[41]對SD大鼠進行醋酸潑尼松龍肌內注射，用藥第3日大鼠即出現食欲下降、倦怠少動等表現，后牙槽骨逐步呈現骨質疏松性改變，驗證了肌內注射糖皮質激素構建牙周炎模型的可行性。但也有學者報道，單純糖皮質激素失調不會引起明顯的牙周炎癥，只會加重牙周炎的程度[42]。目前這種方法尚不成熟、重復性低，對牙周炎的影響程度和機制還亟待進一步研究，但可用于探究應激時全身激素水平變化對牙周炎的影響。

2.6綜合方法構建模型 單一方法構建模型雖然操作簡便，但并不能很好地模擬人發病過程中諸多因素的相互作用，與真實情況存在較大差異，實驗周期一般較長，可控性也相對差。隨著動物牙周炎模型的日趨成熟，越來越多的學者青睞于多種方法聯合應用建模，以達到不同的實驗目的。一項對比實驗證明，兩種或兩種以上因素的聯合刺激有助于縮短實驗周期，提高建模效率[43]。常見的方法有結扎線法配合高糖喂養、細菌接種配合高糖喂養、細菌感染合并結扎絲線、黏結牙石加細菌接種等，通常以一種因素的作用為主，其他因素輔助加重和加快牙周炎癥進程[44-46]。在此過程中，各種因素不僅相互促進，而且在一定程度上彌補了彼此的局限性。如細菌接種雖然作為始動因素對局部組織的刺激作用很強，但忽略了全身因素的影響，結扎和牙石同樣只適于局部直接研究。激素水平和血糖水平的改變能夠反映臨床上部分患者的發病過程，使實驗目的更明確，實驗結果更有參考價值。此外也有一些學者采用特殊方法建立模型，如剝離大鼠下頜第一磨牙牙周與牙根面后，每3天緩慢灌注0.2 mL凝膠至齦下，配合高糖飼料喂養，由于凝膠培養基為厭氧菌提供了適宜的生存環境，可以促使厭氧菌快速增殖，與僅剝離牙齦和糖飼料喂養的大鼠相比，該組大鼠炎癥發展更快，且可累及全側甚至對側牙周組織[47]。此方法刺激胃部，可產生胃火型牙周炎，彌補了該型牙周炎的空白，對中醫藥的研究有重要意義。

綜上，牙周炎動物模型的建立可采用不同方法，若采用某種單一方法進行牙周炎動物模型的構建會導致病變局限，忽略了全身性因素的影響，而多個因素同時運用，有利于建立快速、穩定的牙周炎模型。然而無論哪種模型都無法完全復制人類牙周炎發生和發展的所有方面，如接種細菌時使用的只是存在于任何牙菌斑生物膜中的至少150種微生物類型中的一種或兩種；應激時全身激素水平的變化和實驗中局部注射激素對牙周炎癥的影響也有區別；在選擇建模方法時，除考慮可操作性、成功率、建模周期等外，還應注意不同實驗目的對實驗模型的需求，以及一些常見因素如性別、年齡、麻醉藥品對實驗的影響等。

3 影響因素

評估檢測牙周炎模型時發現，雌性小鼠牙齦炎癥介質的表達水平和牙槽骨缺失程度明顯高于雄性小鼠[48]。但在實際臨床工作中，男性較女性更易患牙周炎，這可能與男性吸煙以及不良口腔衛生習慣致牙結石增多和牙周組織破壞有關。有研究表明，尼古丁會造成牙槽骨吸收、牙周袋形成，同時抑制牙周組織再生修復，并呈現劑量依賴性[49]。也有學者認為，男性體內的雄激素可以調節頜下蛋白酶的活性，促進菌斑鈣化和牙石形成，讓男性較女性更易罹患破壞性牙周炎[50]。牙周炎的發病率隨著年齡的增長而升高，但目前人們對牙周炎與年齡的相關性了解甚少。近年來也有研究證實了肥胖與牙周炎的關系[51]，因此建模時不能忽略性別、年齡、體重等因素對疾病的影響。由于建立動物牙周炎模型需要反復麻醉，可能導致多種麻醉不良反應，如體重下降、心肺功能抑制、內臟病變等[52]，此外，動物在應激狀態下體內激素的水平也會發生變化。

4 結 語

牙周炎的治療是當前國內外學者研究的熱點問題，尋找合理有效的藥物至關重要，成功建立符合要求的牙周炎動物模型是實驗研究的關鍵。雖然動物模型提供了大量重要數據，但其研究結果只能提供某種新型藥物安全性和潛在功效的初步信息，不能直接將這些結果等同于人類牙周炎的結果[53]。另外，全身因素導致的個體差異很難解釋，一些口腔衛生習慣差的群體并未表現出牙周炎癥，而某些口腔菌斑較少的人卻患上嚴重的牙周炎。真正能夠模擬人類牙周病自然發病機制、實用且重復性高的模型還亟待進一步探索和研發。