抗心肌缺血再灌注損傷多肽類藥物的研究進展

何小奇，鄧 莉

(廣東醫科大學寄生蟲學教研室，廣東 湛江 524023)

心血管疾病尤其是缺血性心臟病嚴重威脅人類健康。有90%以上的缺血性心臟病是由冠狀動脈狹窄、堵塞引起[1]。冠狀動脈長時間堵塞可引起心肌缺血、缺氧甚至壞死，故血流的早期恢復是挽救壞死心肌的唯一途徑。但研究發現，心肌缺血再灌注往往會加重心肌損傷，即出現心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2]。MIRI指缺血缺氧的心肌組織恢復血液供應后，心臟結構的進一步破壞以及心肌細胞代謝功能障礙的進一步加重，甚至發生不可逆性損傷，主要包括梗死面積的再擴大和危及生命的心律失常。臨床上采用傳統治療方法對缺血心肌的治療效果欠佳，如溶栓治療或經皮冠狀動脈介入治療[3]。目前，MIRI的發病機制尚未完全闡明，一般認為氧化損傷、炎癥、鈣超載、凋亡、自噬等是MIRI發生的重要原因，且各損傷機制間的聯系和相互作用還可誘發更嚴重的損傷[4-5]。

多肽類藥物由α-氨基酸以肽鍵連接而形成，也是蛋白質經過水解后形成的中間產物，其中寡肽由2～10個氨基酸組成，而多肽由10～50個氨基酸組成。多肽類藥物具有活性高、療效穩定、不良反應小、用量少等特點，在臨床上得到廣泛應用[6]。近年來，隨著基因組學、蛋白組學和生物信息學研究的快速發展，多種有效技術(如組合化學、高通量篩查等)被用來篩選各種多肽，因此用于疾病診斷、治療和預防的多肽類藥物的種類和數量逐漸增多。目前，多肽類藥物的研究開發已經延伸到疾病防治的多個領域，新型多肽類藥物不斷出現，對治療MIRI、獲得性免疫缺陷綜合征、肝炎、糖尿病、惡性腫瘤和慢性疼痛的效果顯著[7]。臨床前研究中，已發現多種多肽類藥物具有較理想的防治MIRI的效果[8]。現對多種抗MIRI多肽類藥物予以綜述，以期為多肽類藥物抗MIRI作用及其機制的深入研究提供參考，并為其臨床開發與應用提供新思路。

1 MIRI的臨床表現

1.1再灌注性心律失常 再灌注性心律失常通常發生于再灌注的起始階段，時間長短不一，可發生也可不發生。心律失常通常表現為期前收縮、自發性室性心律失常、室性心動過速、心室顫動等。MIRI一般發生在動物實驗研究心肌再灌注后15 min左右，而臨床患者冠狀動脈溶栓治療后，一般不出現嚴重的心律失常，可能是依次進行的溶栓治療、再灌注和冠狀動脈再通對心肌產生不同影響所致，故需注意MIRI動物模型的選擇[9]。然而，心肌梗死急性期缺血引起的致死性室性心律失常(如室性心動過速、心室顫動等)常會導致患者猝死，即使及時接受再灌注治療的急性心肌梗死患者仍有可能發生猝死。研究發現，再灌注性心律失常主要與缺血時間的長短、缺血的嚴重程度、再灌注血流情況、缺血心肌的數量或范圍、電解質紊亂程度等因素密切相關，其發病機理可能包括MIRI期間的氧化損傷、鈣超載以及心肌膜ATP依賴性鉀通道開放等變化導致心肌細胞的興奮性和傳導性改變；MIRI期間引起的心肌細胞電解質紊亂、心室顫動閾值降低等導致的室性心律失常；MIRI期間大量兒茶酚胺釋放導致心肌細胞自律性提高[10-11]。

1.2再灌注性心肌頓抑 心肌頓抑于1982年由Braunwald和Kloner[12]率先提出，指心肌發生缺血再灌注后，缺血所造成的心肌部分功能(結構、轉運、代謝等)需要經過一段時間的自身調節才能恢復的狀態，即缺血再灌注后的可逆性心肌損傷和亞致死性推遲恢復的過程。許多心臟病并發癥的發生均與心肌頓抑狀態有關，心肌頓抑對臨床治療效果的影響較大，并可阻礙疾病恢復。心肌頓抑的發生主要與鈣超載、過氧化損傷、心肌灌注障礙、心肌細胞興奮-收縮偶聯異常、線粒體能量缺乏及功能障礙等因素有關，而鈣超載和氧化損傷是心肌頓抑發生的主要機制[13]。

1.3心功能損傷 心功能損傷是MIRI的主要臨床表現之一，其中心率、左心室收縮壓、左心室內壓最大上升速率以及左心室內壓最大下降速率是評價心臟功能的重要參數[14]。心率是心功能改變的敏感指標；左心室收縮壓和左心室內壓最大上升速率可反映心肌的整體收縮功能，左心室收縮壓或左心室內壓最大上升速率降低表明左心室收縮功能下降；左心室內壓最大下降速率反映左心室心肌的舒張功能，其降低則表明左心室舒張功能異常。由此可見，上述指標可很好地評價MIRI動物或患者的心功能，對評價新藥的臨床治療效果有很好的啟示作用。

2 MIRI的治療原則

2.1MIRI的缺血預適應 缺血預適應指冠狀動脈短暫、多次缺血后進行的心肌再灌注，可對心肌產生一定的保護作用，若心肌對長時間缺血的耐受性明顯增強，可有效減輕MIRI。缺血預適應能夠對心肌起到雙相保護作用，一般在缺血預處理后幾分鐘迅速進入早期保護階段，維持時間為2～3 h，主要通過激活緩激肽的快速信號和G蛋白偶聯相關受體(如阿片受體、腺苷受體等)起作用；而遲發保護階段一般發生在心肌缺血后12～24 h，持續時間為4 d，主要由內皮細胞抗氧化酶進行缺血保護，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和熱激蛋白70等[15]。目前，臨床上已不應用缺血預適應的主要原因是：①心肌缺血前進行缺血預適應刺激，其保護作用的獲得以心肌細胞缺血為代價，臨床應用范圍明顯受限；②缺血預適應可引起動脈粥樣硬化加重和冠狀動脈破裂，對心臟功能也造成嚴重影響[16]。

2.2藥理性預適應 藥理性預適應指再灌注前使用各種有效活性物質進行缺血預處理，誘導缺血耐受的過程，即采用藥物替代缺血刺激所產生的預適應。主要通過激活ATP敏感性K+通道、一氧化氮通道和N-甲基-D-天冬氨酸受體等保護心臟，臨床應用范圍較廣[17]。目前，藥理性預適應多應用于動物實驗過程，可作為藥物治療前景的預判，為深入研究缺血預處理奠定基礎。近年來，中西醫對藥理性預適應研究側重點不一，西醫研究的熱點集中于受體、酶以及離子通道激動藥等；而中醫研究的熱點集中于中藥及其藥效成分，如丹參、刺五加、黃芪、人參皂苷Rb1、川芎嗪等。在藥理性預適應研究方面，多肽類藥物對MIRI具有較好的缺血耐受性，其作用機制主要與改善細胞內鈣超載、降低氧自由基的生成和減少炎癥因子產生等有關[18-19]。

2.3缺血后適應 缺血后適應指心肌長時間缺血后，在再灌注開始時立刻反復進行多次缺血處理和短暫復流，隨后進行持續性復流，增強心肌對缺血的耐受性過程。缺血后適應對心肌的保護強度不遜于缺血預適應，但真正的臨床實施存在較大困難。缺血后適應的潛在保護機制是通過抑制細胞凋亡信號通路減少氧自由基產生，并可激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路，從而減輕炎癥反應[20]。然而，各種信號通路之間也會互相影響，如降低氧自由基可抑制細胞凋亡信號通路，協同缺血后適應起到MIRI保護作用。當缺血后適應發揮作用后，激活蛋白激酶B信號通路，進一步激活mTOR，隨后促進細胞增殖分化，并抑制炎癥反應。

2.4藥物后處理 藥物后處理是對缺血后適應的深入研究，指長時間心肌缺血后，通過藥物干預(于再灌注前或再灌注開始的前幾分鐘內用藥)減輕MIRI的處理過程[21]。缺血后處理能較好地解決處理心肌缺血時機的問題，但仍無法避免心肌的創傷性損傷。隨后，為了達到更好的MIRI保護作用，相關研究熱點逐漸轉移到藥物后處理。藥物后處理是一種外源性介入方式，其對心肌的潛在保護機制與缺血后處理非常相似，且較缺血后處理具有更多的優點，如具有較高的安全性、可控性、可預測性、操作簡便性，臨床應用價值很大。

3 多肽類藥物及作用機制

3.1多肽類藥物與氧化損傷 氧化損傷是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子[如活性氧類(reactive oxygen species，ROS)和活性氮]產生過多，氧化程度超出機體的抗氧化能力，引起氧化系統和抗氧化系統失衡，進而導致組織損傷。氧化損傷被認為是多種組織缺血再灌注損傷的重要致病機制，主要由ROS和活性氮等活性物質組成[22]。機體存在兩類抗氧化系統，一類是酶抗氧化系統，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等；另一類是非酶抗氧化系統，包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽等。自由基含有不成對的電子，生物活性異常活躍，極易發生過氧化反應，包括氧自由基和烷自由基。受控的自由基可被用來殺滅細菌和寄生蟲，還能參與清除毒素，保護機體免受傷害。若自由基數量過多并失去控制，當抗氧化物質不足時，自由基也可以傷害正常細胞。研究表明，氧化應激是MIRI發展的重要原因，反映了體內氧化劑與抗氧化劑的失衡，MIRI引起ROS大量生成，細胞脂質、蛋白和DNA等嚴重受損，最終導致細胞衰老和凋亡[23]。

半乳糖凝集素-3屬于凝集素家族的成員，大約由130個氨基酸組成。結構中有3個獨特的結構域：①一個包含甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸的重復序列；②專門與含有n-乙酰乳糖胺的糖蛋白結合的結構域；③一個短NH2端包含一個絲氨酸磷酸化位點。半乳糖凝集素-3在體內多種細胞中均有表達，在小鼠MIRI模型中，半乳糖凝集素-3可顯著升高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和過氧化氫酶的活性，抑制自由基產生，從而改善MIRI[24]。pNaKtide是來源于鈉鉀ATP酶α1亞單位N端的多肽，研究表明，pNaKtide能夠減弱鈉鉀ATP酶/Src/ROS信號通路的活性，抑制心肌細胞的氧化應激反應，從而起到心肌保護作用[25]。相關研究發現，鹿茸中分離純化得到的鹿茸多肽(分子量約為6 500)能明顯升高MIRI大鼠模型心肌組織中超氧化物歧化酶的活性，并降低血清丙二醛水平，從而改善MIRI[26]。

3.2多肽類藥物與炎癥 炎癥在心臟功能的病理生理機制中起關鍵作用。炎癥是具有血管結構的活體組織對損傷因子的防御反應，一般炎癥反應是宿主防御損害和組織修復的積極過程，過度的炎癥反應可產生大量的促炎癥因子、細胞表面分子和趨化因子，最終引起組織發生嚴重的功能損害。炎癥的調節機制較復雜，目前尚未完全闡明[27]。炎癥通路中的模式識別受體可識別病原生物表面的病原體相關分子模式，并啟動機體炎癥，是機體固有免疫的重要組成部分。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是模式識別受體家族的重要成員之一。心肌缺血再灌注發生時，TLRs通過識別損傷相關的分子模式進一步激活下游信號通路，引發一系列的促炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8，從而引起機體的炎癥反應。TLRs不僅是先天性宿主防御的第一道屏障，還可調節機體的適應性免疫應答，其中TLR4在心臟表達最高，在MIRI的炎癥過程中起關鍵作用[28]。

Roh等[29]發現了降鈣素基因相關肽超家族新成員——中葉素，其由47個氨基酸組成，因其結構和功能與腎上腺素相似，又被稱為ADM2。中葉素在人體分布廣泛，在心臟、腦和腎臟均呈高表達，其藥理作用比腎上腺素更強、更廣泛，不僅具有舒張血管、降低血壓等作用，還對MIRI和心力衰竭具有重要的保護作用。對糖尿病大鼠的研究發現，中葉素可明顯降低血清及心肌組織中腫瘤壞死因子-α、IL-1β 和IL-6的水平，從而抑制心肌缺血再灌注后的多種炎癥反應[30]。抑肽酶是一種堿性多肽，作為一種天然的小分子絲氨酸蛋白酶抑制劑，它可以抑制多種絲氨酸蛋白酶的釋放。抑肽酶能有效地降低MIRI過程中血清IL-8和腫瘤壞死因子-α的水平，減輕心肌細胞的損傷程度并減少白細胞浸潤，對缺血再灌注引起的心肌損傷具有保護作用，其機制可能與抑制白細胞活性及減少細胞因子合成和釋放有關[31]。

3.3多肽類藥物與細胞內鈣超載 鈣超載也是MIRI的重要發病機制之一。鈣超載是各種原因引起的細胞鈣平衡系統功能失調和鈣分布紊亂，導致細胞內鈣濃度異常升高或過度蓄積的現象，也稱為鈣超負荷。鈣超載常引發心功能變化(如心室舒張不全)，嚴重者還會導致舒張性心力衰竭，可明顯影響線粒體的氧化磷酸化功能，如激活鈣依賴性磷脂酶和蛋白酶，影響ATP生成，致使細胞能量代謝發生障礙，最終導致細胞凋亡[32]。

血管緊張素1-7是由天冬氨酸、精氨酸、纈氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、組氨酸和脯氨酸所組成的多肽，分子量為899，屬于腎素-血管緊張素系統的成員，具有擴張血管、抑制血管平滑肌細胞增殖等作用。有研究發現，血管緊張素1-7可明顯減少MIRI大鼠心肌細胞舒張期細胞內鈣濃度，提示血管緊張素1-7對心肌缺血再灌注的保護作用與其鈣超載抑制作用密切相關[33]。谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸組成的一種含有巰基的三肽，相對分子質量為307.33，具有抗氧化作用，并可參與肝臟的解毒作用。谷胱甘肽結合小分子氯離子通道蛋白巰基位點，引起蛋白結構改變，抑制離子通道開放，抑制鈣誘導鈣釋放機制，改善鈣超載，從而起到MIRI保護作用[34]。此外，谷胱甘肽也可減少鉀通道開放，降低心肌細胞去極化活性，抑制胞質內鈣超載的發生。

3.4多肽類藥物與細胞凋亡 細胞凋亡是基因控制的細胞自主有序死亡，缺血、炎癥、鈣超載、氧自由基等均可誘導心肌細胞凋亡[35]。研究證實，MIRI會伴隨心肌細胞凋亡，特別是持續性缺血期和缺血再灌注期可見到大量的心肌細胞凋亡[36]。心肌細胞凋亡調控機制分為細胞外途徑和細胞內途徑兩種，且兩種途徑相互作用。多種炎癥因子參與細胞外凋亡途徑，首先炎癥因子與相應的胞外受體結合，誘導相關蛋白的聚集，分別激活凋亡蛋白激酶胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶8，啟動細胞凋亡。氧化應激參與內源性凋亡途徑，過量ROS可激活B淋巴細胞瘤-2，促進促凋亡蛋白Bax的生成，與相應受體結合后增加線粒體膜的通透性，進而誘導多種促凋亡蛋白的釋放，如細胞色素C、核酸內切酶G，激活胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的釋放，從而啟動細胞凋亡。

次血紅素六肽是根據抗壞血酸過氧化物酶的主體結構、微過氧化物酶-9的結構，以亞血紅素為靶分子篩選噬菌體展示肽庫所得到的序列，設計合成的含組氨酸的過氧化物酶模擬酶。研究發現，次血紅素六肽可明顯降低MIRI大鼠心肌細胞的凋亡率，上調MIRI大鼠心肌組織抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2的表達量，升高B淋巴細胞瘤-2/Bax比率，下調胱天蛋白酶3的表達量[37]。

3.5多肽類藥物與自噬 自噬是真核細胞的一種防御和應激調控機制，衰老細胞、受損細胞器和過度蓄積或錯誤折疊的蛋白質主要通過細胞自噬途徑進行消除和再利用，維持細胞內環境相對穩定，是細胞內廣泛存在的正常生理過程和防御體系[38]。自噬過程包括分隔膜的形成、自噬體的形成、自噬溶酶體的形成和內容物的降解，自噬通過一系列保守的自噬相關基因(autophagy-related genes，ATG) 進行調控。心肌細胞缺血早期可引起能量代謝障礙，導致ATP/AMP比值下降，激活LKB1-AMP活化的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)信號通路，即LKB1激活信號分子AMPK，AMPK激活TSC1/2復合體，進而抑制mTOR的活性，從而誘導ATG1、ATG1與ATG11、ATG1與ATG13、ATG1與ATG17復合物的形成，進一步啟動自噬并形成自噬體。在心肌細胞缺血期，自噬對心肌細胞的存活產生積極作用，如降解細胞內衰老及功能不全的細胞器和蛋白質，自噬降解后可釋放出氨基酸和脂肪酸，并通過三羧酸循環產生ATP，補償心臟缺血的能量危機；在心肌再灌注期，自噬仍處于激活狀態，但誘導自噬的途徑與心肌缺血階段不同，再灌注后，心肌細胞再次得到充足氧供，在缺血階段通過LKB1-AMPK信號通路誘導的自噬途徑被抑制，而Beclin-1在再灌注期的自噬過程中發揮主要作用。Beclin-1的過表達可明顯增加再灌注期間的自噬活性，但目前具體的機制還未完全闡明[39]。

促紅細胞生成素衍生肽又稱螺旋B表面肽，是在促紅細胞生成素結構基礎上衍生出的多肽。螺旋B表面肽既保留了促紅細胞生成素的組織保護活性，又無促紅細胞生成素的不良反應，如不導致血栓形成及高血壓。螺旋B表面肽能顯著抑制細胞自噬，減輕小鼠MIRI，其保護機制可能與激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/mTOR轉導通路相關[40]。mTOR是關鍵的細胞自噬調節因素之一，許多信號轉導通路都交集于mTOR。在機體營養豐富或有生長因子存在情況下，mTOR成為關閉細胞自噬的主要抑制性信號。細胞處于低能量狀態下，上游信號通路LKB/AMPK抑制mTOR磷酸化，促使自噬，進而產生更多的能量[40]。

4 小 結

多肽類藥物作為重要的生物醫藥種類，具有適應證廣、安全性高且療效顯著等優點，具有廣闊的臨床應用前景，對MIRI的治療效果較理想，其具體作用機制涉及氧化損傷、炎癥、鈣超載和自噬等。目前，對MIRI具有改善作用的多肽主要有半乳糖凝集素-3、降鈣素基因相關肽、血管緊張素1-7、次血紅素六肽和促紅細胞生成素衍生肽等。隨著相關基礎研究以及臨床研究的不斷深入，越來越多高效低毒的多肽類藥物將不斷地涌現，將對MIRI的防治發揮更大的作用。