SIRT1調節晝夜節律的研究進展

韋 曉，茅曉東，徐一嬌，陳國芳，劉 超

(南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院內分泌科 江蘇省中醫藥研究院癭病證治重點研究室，南京 210028)

地球上的生命受晝夜交替所造成的明暗循環支配，包括從原核生物到人類的幾乎所有生物體中，均進化出了一套晝夜節律系統[1]。晝夜節律調控了生物體的許多生理活動，如體溫、進食、睡眠和激素變化等，這些生理變化遵循一個約24 h的內在周期，生物體可以通過晝夜節律系統更好地適應生存環境[2]。晝夜節律系統的穩定對健康和壽命非常重要，節律的紊亂會導致失眠、抑郁、冠心病、代謝綜合征、神經退行性疾病和腫瘤的發生，這些疾病的發生發展誘導了機體老化，加速了衰老性疾病的進程[3]。因此，闡明晝夜節律的分子機制，尋找改善節律紊亂的治療靶點，對預防和治療衰老性疾病具有巨大的應用價值。乙酰化和去乙酰化調節是調控晝夜節律的重要分子機制，而沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種去乙酰化酶，它可以通過去乙酰化晝夜節律相關蛋白影響晝夜節律。研究發現，上調SIRT1的表達可以緩解多種衰老性疾病，如心血管疾病、神經退行性疾病、代謝性疾病和腫瘤等，SIRT1可能通過調控晝夜節律發揮以上作用[4]。現就SIRT1調節晝夜節律的研究進展予以綜述。

1 晝夜節律的生理基礎

哺乳動物體內控制晝夜節律的器官為下丘腦的視交叉上核，視交叉上核中約包含15 000個神經元，它們可以感受周圍環境中的光照變化，通過光照的周期性改變調節生物的晝夜節律性[5]。除光照因素外，視交叉上核還受松果體、下丘腦、血管活性腸肽和激素(皮質醇激素和褪黑素等)的影響，這些因素均會影響生物的晝夜節律性[6]。晝夜節律性不只體現在視交叉上核，外周組織也具有自身的晝夜節律性，如肝臟和白色脂肪組織，晝夜節律是一個遍布全身的網絡系統[7]。晝夜節律的紊亂會加速衰老，許多衰老性疾病的發生均與晝夜節律的紊亂相關[2]。有觀點認為，晝夜節律失衡是衰老的關鍵因素[7]。

2 晝夜節律的分子基礎

在分子水平上，晝夜節律受到一組節律相關蛋白表達的影響，這些蛋白影響了10%～15%的基因并以晝夜節律的方式轉錄，節律相關蛋白的周期循環表達對晝夜節律的形成至關重要[8]。

晝夜節律運動輸出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK)是晝夜節律的核心調控蛋白，它由clock基因編碼，在各個器官與組織中表達，人的clock基因位于第4號染色體長臂(4q12)[9]。CLOCK的C端與組蛋白乙酰化酶具有同源性，它能催化組蛋白H3和腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1,BMALl)的乙酰化，且BMAL1的乙酰化必須有CLOCK存在[10]。CLOCK和BMAL1同屬于堿性螺旋-環-螺旋家族蛋白，它們具有保守的堿性螺旋-環-螺旋和周期蛋白-芳香烴受體核轉運蛋白-類泛素蛋白相互作用基序結構域。CLOCK和BMAL1會形成含有堿性螺旋-環-螺旋-周期蛋白-芳香烴受體核轉運蛋白-類泛素蛋白相互作用基序結構域的異二聚體復合物，CLOCK/BMAL1復合物可以與調控基因上的E-box元件結合，激活下游基因的表達[11]。

除CLOCK和BMAL1外，哺乳動物體內還發現多種晝夜節律相關蛋白，如周期蛋白、隱花色素和核受體亞家族1D組成員1等[12]。其中，周期蛋白蛋白分為周期蛋白1、周期蛋白2、周期蛋白3三種類型，隱花色素蛋白分為隱花色素1和隱花色素2兩種類型，這些蛋白的周期性變化產生了晝夜節律性振蕩。

3 晝夜節律的分子機制

晝夜節律相關基因的表達受乙酰化與去乙酰化酶的調控，并存在負反饋環路調節[13]。CLOCK/BMAL1復合物與待表達基因上的E-box順式作用元件結合后，CLOCK發揮乙酰化作用，乙酰化BMAL1、組蛋白H3和組蛋白H4，啟動周期蛋白、隱花色素、核受體亞家族1D組成員1等蛋白的合成，合成后的周期蛋白和隱花色素形成異二聚體，受乙酰化BMAL1的招募轉移到細胞核內，反饋性抑制CLOCK/BMAL1復合物的作用。此時，去乙酰化酶發揮作用，其將周期蛋白、BMAL1、組蛋白H3和H4的乙酰化位點去乙酰化，從而終止目的基因轉錄[14]。同時，核受體亞家族1D組成員1會與下游基因的受體酪氨酸激酶樣單受體應答元件結合，抑制基因的轉錄。

CLOCK/BMAL1異二聚體調控鐘控基因的轉錄，而鐘控基因又反過來影響CLOCK/BMAL1復合物乙酰化的振蕩機制，這種內在的分子機制調控的基因存在一個24 h的表達周期，它在宏觀上調控了進食、激素、體溫和代謝等多種生理功能[15]。

參與晝夜節律的去乙酰化酶為SIRT1，它是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的組蛋白去乙酰化酶，其作用與CLOCK相反，可以去乙酰化組蛋白H3的賴氨酸-9和賴氨酸-14[16]。SIRT1除可以去乙酰化組蛋白外，還可以去乙酰化多種胞質蛋白，如p53蛋白、叉頭框蛋白O1和低氧誘導因子1α等，它是細胞代謝的重要調控蛋白，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、延長壽命的作用[17]。

SIRT1是細胞內重要的去乙酰化酶，而乙酰化修飾結構域存在于多種組蛋白分子中。CLOCK/BMAL1復合物與SIRT1通過乙酰化與去乙酰化組蛋白的方式調控染色質異構的變化，達成基因的節律性表達[18]。CLOCK/BMAL1復合物指導組蛋白H3在賴氨酸-9和賴氨酸-14的乙酰化，這種組蛋白翻譯后修飾與晝夜節律基因的表達密切相關。有研究證明，組蛋白H3的絲氨酸-10磷酸化與賴氨酸-14的乙酰化具有相關性，且H3的磷酸化作用先于乙酰化，H3的磷酸化可能更有利于CLOCK/BMAL1復合物的結合[19]。此外，組蛋白甲基化對乙酰化也具有影響，有學者在基因增強子人類同源物2的表達中發現，組蛋白H3的賴氨酸-27位點的甲基化有助于基因表達的啟動；在晝夜節律蛋白中發現，組蛋白H3的賴氨酸-27甲基化也參與per1和per2基因的表達調控[20]。

4 SIRT1與晝夜節律

自2002年起，晝夜節律調控的分子機制被逐漸闡明，CLOCK作為乙酰化酶的核心機制被不斷揭示，但去乙酰化過程研究相對較少。SIRT1作為晝夜節律調控中的關鍵去乙酰化酶需要更多的深入研究，探尋反饋調節中去乙酰化作用的細節和規律。

SIRT1為哺乳動物體內的Sir2同源蛋白，Sir2在酵母、線蟲和果蠅體內被發現，它可以被熱量限制激活，延長壽命[21]。在酵母菌中，Sir2介導端粒的轉錄沉默并調節衰老速度，它通過去乙酰化沉默細胞內的基因表達，調控細胞的代謝過程[22]。在哺乳動物體內有7種Sirtuins家族蛋白，分別被命名為SIRT1～SIRT7，其中SIRT1被研究得最為透徹，它在對抗衰老性疾病的研究中發揮重要作用，可以調節多種代謝過程[16]。SIRT1在低營養環境下被激活，如禁食和熱量限制，它的激活有利于動物在這些條件下生存，故SIRT1被認為是研究代謝與衰老關系的重要連接[23]。SIRT1的去乙酰化存在于胞核和胞質中，在細胞核中，SIRT1可以去乙酰化組蛋白H3賴氨酸-9和賴氨酸-14、H4組蛋白賴氨酸-16[24]；在細胞質中，它可以去乙酰化p53、叉頭框蛋白O1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α和肝X受體[25]。因此，SIRT1具有廣泛的調節代謝作用。

Nakahata等[26]發現，SIRT1可以去乙酰化BMAL1，并調節其功能。SIRT1的缺乏會導致晝夜節律的紊亂，如果敲除sirt1基因，per基因的表達會發生變化，導致晝夜節律的延長，從而影響生物體的壽命。另一方面，Asher等[27]報道SIRT1在小鼠成纖維細胞和肝細胞中調控晝夜節律相關蛋白，表明SIRT1和晝夜節律蛋白具有相互作用。研究發現，SIRT1具有晝夜節律調控器的作用，它調節了晝夜節律蛋白的表達，尤其是對組蛋白H3乙酰化的調控[28]。而sirt1基因的敲除或抑制其表達會影響組蛋白H3和BMAL1的去乙酰化[29]。在sirt1基因敲除小鼠的肝臟細胞中，晝夜節律轉錄周期不穩定，早期轉錄增加，后期轉錄減少[30]。此外，在sirt1基因敲除小鼠的胚胎成纖維細胞中，組蛋白H3賴氨酸-9和賴氨酸-14呈高乙酰化[31]。在特異性敲除sirt1基因的小鼠肝臟細胞中，BMAL1的乙酰化增加，證明SIRT1有助于體內晝夜節律的調控[32]。因此，SIRT1作為晝夜節律的振蕩器，其將細胞內的代謝信號附加晝夜節律性，這種節律性是否穩定與衰老性疾病具有很強的關聯。

5 NAD+與晝夜節律

SIRT1的作用受NAD+的影響，NAD+是許多酶發揮作用均必須存在的輔酶，它由色氨酸前體、煙酸和煙酰胺合成生成，哺乳動物NAD+的合成途徑分為從頭合成途徑和維生素B12轉化途徑[33]。在SIRT1的去乙酰化過程中，煙酰胺從NAD+中釋放，SIRT1將底物的乙酰基轉移到NAD+上并去乙酰化，生成代謝產物O-胰腺-ADP核糖，煙酰胺和O-胰腺-ADP核糖在煙酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)的作用下重新合成NAD+[34]。

NAMPT為NAD+的合成酶[35]。有研究發現，小鼠體內的NAMPT/NAD+顯示出晝夜節律性，在黑暗期開始之前，NAMPT蛋白水平降低，這與小鼠開始進食的時間一致，提示營養激增或攝食行為可能對NAMPT蛋白的表達進行調節[36]。即使小鼠持續存在于黑暗環境，NAMPT表達的振蕩性依然存在，說明NAMPT的表達存在晝夜節律性。此外，NAD+的表達水平與NAMPT的表達呈現相同的振蕩周期。基于這種振蕩周期，一種NAMPT/NAD晝夜調控系統被提出，這種調控系統在胰島β細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞和血管上皮細胞等中均被證實存在節律性[37]。

NAMPT分為細胞內和細胞外兩種形式，其中細胞外NAMPT是一種分泌蛋白，有助于NAD+的細胞外合成，所以血清中也可以檢測到NAD+的存在。NAMPT被證明在SIRT1的功能活性中發揮重要作用[38]。在小鼠體內，增加NAMPT的表達可以增加細胞內NAD+和SIRT1的活性[39]；在血管平滑肌細胞中，增加NAD+可以對抗衰老延長壽命[40]；在胰島β細胞中，NAMPT/NAD和SIRT1對胰島素的合成和分泌也有調控作用，NAMPT/NAD系統介導的SIRT1活性可以協調晝夜節律、細胞代謝和延緩衰老[38]。

內源性NAMPT缺乏的組織可能更多的依賴外源性NAMPT，如果外源性NAMPT發生變化，會直接影響這些缺乏內源性NAMPT組織的晝夜節律性[39]。因此推測，缺乏內源性NAMPT的組織對晝夜節律的影響非常敏感，外周NAMPT水平降低會直接導致這些組織器官的SIRT1活力下降，晝夜節律性喪失。如胰島β細胞可能依賴外源性NAMPT調節SIRT1活性，有研究證明，服用煙酰胺單核苷酸可使老齡小鼠體內葡萄糖刺激的胰島素分泌水平恢復到較高水平[38]。因此，胰島β細胞功能的損傷很可能與NAMPT/NAD系統調節的SIRT1相關，這種損傷直接影響了代謝系統的紊亂。

6 SIRT1調節晝夜節律的干預手段

作為調控晝夜節律的去乙酰化酶，越來越多的證據證明，SIRT1是改善晝夜節律的重要作用靶點[41-43]。已知許多干預手段可以通過激活SIRT1調節晝夜節律，如熱量限制、白藜蘆醇和褪黑素。

熱量限制為在不缺少必需營養物質的情況下，減少進食總熱量的干預手段，這種干預被證明可以延緩衰老，并在多種物種中得到證實，如酵母、果蠅、線蟲、魚、大鼠、小鼠、倉鼠、犬和猴[44]。為研究晝夜節律與衰老之間的作用關系和分子機制，Sato等[44]比較了年輕和年老小鼠的基因轉錄本，結果發現年老小鼠的節律性轉錄基因只有年輕小鼠的25%左右，其原因可能為細胞內NAD+水平降低和組蛋白乙酰化異常。而限制了30%進食的年老小鼠與年輕小鼠的轉錄本趨于一致，提示熱量限制可以重構基因表達的節律性[45]。這些結果證實，熱量限制可以通過調控晝夜節律緩解衰老的進程。在另一項研究中，Solanas等[46]探討了干細胞的晝夜節律與衰老之間的聯系。結果顯示，成體干細胞負責維持組織和器官的功能穩定，成體干細胞的功能和數量下降是衰老的重要因素，但成體干細胞的晝夜節律失衡會誘發細胞內的氧化應激和內質網應激。研究顯示，熱量限制可以降低年齡因素導致的細胞內氧化應激、內質網應激和蛋白異常積累，并提高蛋白的新陳代謝周轉率[47]。雖然熱量限制改善細胞生理活動的分子機制尚不完全清楚，但其有益效果與SIRT1的增加和激活相關。

熱量限制是一種有效對抗衰老的策略，但限制的程度和時間沒用明確標準，且這種干預難以被患者堅持，故研究熱量限制模擬劑成為研究熱點。其中，有些化合物可以模擬熱量限制的作用，達到改善代謝、延長壽命的效果[41]。如白藜蘆醇是研究最多的熱量限制模擬劑，它是一類植物多酚，化學名為3,4′,5-三羥基芪，主要存在于桑葚、虎杖、花生、葡萄等植物中。Sun等[48]研究發現，白藜蘆醇可以修復高脂飲食引起的晝夜節律紊亂。高脂飲食可以誘導C57BL/6小鼠的節律相關基因表達受損和脂代謝受損，而白藜蘆醇治療可以改善C57BL/6小鼠體內的sirt1、clock、bmal1、per2基因表達，提示白藜蘆醇可通過影響晝夜節律恢復小鼠的正常脂代謝。

除白藜蘆醇被發現可以修復基因轉錄的晝夜節律性外，褪黑素也被證實可以改善晝夜節律性[42]。褪黑素是松果體分泌的吲哚類激素，它的合成主要受光照周期的調控。哺乳動物體內褪黑素的分泌存在一個24 h的節律，但隨著年齡的增長，褪黑素的分泌周期會越來越不穩定，這表明褪黑素與衰老性疾病之間存在聯系。隨著年齡的增加，褪黑素的分泌缺失會誘導晝夜節律的紊亂，導致各種基因表達的不協調，使機體健康情況下降[49]。有學者利用衰老模型SAMP8小鼠進行研究發現，SIRT1和褪黑素存在聯系[50]。褪黑素通過激活SIRT1，去乙酰化組蛋白，調控下游基因的表達，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α、叉頭框蛋白O1、核因子κB和p53。雖然褪黑素和SIRT1之間的關系需要更多研究證實，但這種聯系可能成為調控晝夜節律、對抗衰老、神經保護和癌癥治療的重要研究方向。

熱量限制、白藜蘆醇和褪黑素對衰老相關的生理功能具有廣泛影響，如調節代謝水平、調節線粒體功能、抗氧化保護，以延緩衰老相關疾病，這些保護作用與SIRT1的激活以及晝夜節律的穩定相關，可作為治療衰老性疾病的有效手段。

7 小 結

晝夜節律與細胞和器官的功能緊密結合，調控著關鍵的代謝過程和生理途徑。因此，揭示控制晝夜節律的分子機制將成為研究細胞代謝的關鍵。乙酰化和去乙酰化調節為晝夜節律調控的開關，作為此過程中的去乙酰化酶，SIRT1作用的規律需進一步研究，且激活SIRT1的藥物或干預方式，如熱量限制、白藜蘆醇需要更多的臨床證據證明其有效性，以為更好地改善晝夜節律、預防和治療衰老性疾病提供臨床依據。在基礎研究中，已明確SIRT1可以調控晝夜節律，未來需深入探討其在晝夜節律導致的衰老性疾病中的分子機制。