CRISPR/Cas9技術定點編輯水稻谷蛋白基因GluA3

周 優，林冬枝，2，董彥君，2，3*

(1上海師范大學生命科學學院，上海 200234；2上海師范大學遺傳研究所，上海 200234；3上海市植物分子科學重點實驗室，上海 200234)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為全球半數以上人口的主食，也是人體攝入植物蛋白的主要來源。稻米貯藏蛋白約占其干重的8%—16%，其含量及組分很大程度上決定著稻米的品質和營養價值。因此，提高稻米蛋白含量并改良其組分是水稻品質改良的重要目標。稻米中的蛋白根據其溶解特性可分為三大類，即鹽溶蛋白(包括清蛋白和球蛋白)、醇溶蛋白和溶于酸或堿的谷蛋白，其中以谷蛋白為主，約占全蛋白的80%，而醇溶蛋白只占5%—10%[1-5]。與醇溶蛋白相比，谷蛋白具有易消化、富含賴氨酸、精氨酸等特點，是優良的植物蛋白[4]。Tanaka 等[6]從稻米蛋白中分離出兩種蛋白體，即蛋白體I(protein body，PB-I)和蛋白體Ⅱ(PB-Ⅱ)。其中，以醇溶蛋白為主的PB-I由10 ku、13 ku、16 ku和57 ku 的多肽構成，以谷蛋白為主的PB-Ⅱ主要含有22 ku、26 ku、37 ku、38 ku和39 ku的多肽組分?？蒲泄ぷ髡咭谚b定出13 ku醇溶蛋白組分缺失的突變體[7-8]和低谷蛋白的突變體(如Lgc-1)[9]以及谷蛋白57 ku前體的積累缺少突變體[10]。研究表明，水稻谷蛋白基因原始翻譯產物是一類氨基酸殘基數目在 495—500 aa、大小約為 57 ku 的前體H。這些前體經過穿膜、剪切和酶解等一系列復雜過程最終形成成熟的22 ku和37—39 ku谷蛋白亞基并貯存于蛋白體中。目前，多數水稻谷蛋白基因已被分離克隆，根據序列相似性可將其分為GluA和GluB兩個亞家族[11]。GluA亞家族至少包含3個不同編碼基因，即GluA1、GluA2和GluA3[12]。近年來，水稻谷蛋白突變體的遺傳變異機理和育種等方面的研究取得了明顯進展[13]。在遺傳機理方面，日本科學家[9]對利用低谷蛋白突變材料NM67育成的Lgc-1相關品種的低谷蛋白特性進行了深入研究，揭示了Lgc-1突變體的低谷蛋白特性是由于GluB亞家族基因GluB4和被剪切了部分片段的GluB5基因以尾對尾反向重復形成的結構造成的。即在GluB4和GluB5之間缺失一段4.5 kb的片段，由于GluB4和GluB5的同源性極高，在 RNA拼接過程中產生了發夾式的RNA雙鏈結構，導致了Lgc-1突變體的低谷蛋白性狀。對于某些特定的人群如腎臟病、糖尿病患者來說，大量吸收消化谷蛋白會導致病情惡化。因此，育種家們利用低谷蛋白Lgc-1突變體材料選育出低谷蛋白水稻品種‘春陽’(http：//ineweb.narcc.affrc.go.jp/search/ine.cgi?action=inedata_top&ineCode=HOK01830)和‘W3660’[14]，又利用Lgc-1低谷蛋白相關品種與球蛋白缺失突變體配組育成了具有更低谷蛋白含量的水稻品種‘LGC-Katsu’和 ‘LGC-Jun’[15]。本研究組也以水稻品種‘春陽’作為親本育成了能輔助治療腎病的低谷蛋白品種‘益腎稻1號’(http：//www.jyb.cn/high/gdjyxw/201311/t20131104_558 198.html)。因此，水稻谷蛋白突變體不僅是進行真核生物貯藏蛋白生物合成和基因表達調控研究的重要材料，也是培育功能性專用水稻品種不可或缺的優良種質資源[13，16]。眾所周知，CRISPR/Cas9是一種快速有效的基因組定點編輯技術，已成為植物分子育種的重要手段。目前，未見利用CRISPR/Cas9技術創制水稻谷蛋白基因突變體的報道。本研究嘗試利用CRISPR/Cas9技術對水稻谷蛋白基因GluA3(LOC_Os03g31360)進行定點編輯，以期為改善水稻谷蛋白品質的育種提供中間材料和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗的遺傳轉化材料為浙江省嘉興市農業科學院選育的優質高產粳稻品種‘嘉花1號’，在南方粳稻區廣泛種植。試驗水稻材料種植于人工氣候箱以及上海師范大學植物園內的封閉試驗基地，常規水肥管理。

1.2 載體構建及轉基因研究

本試驗使用的CRISPR/Cas9 載體由華南農業大學劉耀光院士[17]提供，U6a載體部分序列如圖1A所示，Cas9 載體結構如圖1B所示。利用CRISPR引物設計軟件 (http：//crispr.dbcls.jp/)針對水稻谷蛋白基因GluA3(LOC_Os03g31360)第4外顯子設計19 bp靶位點序列5’-TCAGGAAGTGCGCGGAAGA-3’，PAM序列為 TGG(圖 1C)，設計的靶點接頭引物為Target-F/R(表1)?；虬行蛄欣肗CBI 網站上的BLAST程序進行篩選，未找到脫靶序列。

LB：載體左邊界；HPT：潮霉素；Ubi：Ubi啟動子；pCas9：Cas9蛋白；OsU6a：水稻U6a啟動子；gRNA：向導RNA；RB：載體右邊界圖1 CRISPR/Cas9載體及基因結構圖Fig.1 CRISPR/Cas9 vector and gene structure map

引物名稱引物序列(5’-3’)Target-FGCCGTCAGGAAGTGCGCG-GAAGATarget-RAAACTCTTCCGCGCACTTCCT-GAGluA3-FAGAACGCACTCCTTTCACCTGluA3-RTGCTTGTTGATGGCATTTCT-TAGluA3-Q-FCCGTCGTTTGCTTGTTCCTCGluA3-Q-RACAGTGCGAATCGGCTCAAAOsActin-FAGGAAGGCTGGAAGAGGACCOsActin-RCGGGAAATTGTGAGGGACATHPT-FGATGTTGGCGACCTCGTATTHPT-RGTGTCACGTTGCAAGACCTG

1.3 PCR鑒定分析及 qRT-PCR 分析

取試驗材料單株葉片，采用CTAB法[18]提取全基因組DNA，用于PCR擴增或于-20℃冰箱中保存。PCR體系參照張建輝等[19]方法，PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結束后EB溶液顯色并拍照，進行DNA測序(上海美吉生物公司)。

利用RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司的TransZol Plant)提取水稻根、莖、幼葉、倒二葉、劍葉、穗以及授精15 d后的未成熟胚乳組織中總RNA。以提取的RNA為模板，用反轉錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)合成cDNA，然后進行定量PCR(qRT-PCR)分析，以水稻OsActin基因作為內參基因。qRT-PCR體系為：cDNA 模板1 μL，2×SYBR qPCR Mix (TOYOBO)10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環。采用2-ΔCT法分析數據，確定目的基因的相對表達量。

1.4 突變體農藝性狀調查

水稻生長成熟后，對‘嘉花1號’及突變體材料的株高、有效穗、結實率、千粒重、每穗粒數和單株產量進行考查?？疾?個單株，獲得的數據采用Excel 2010進行統計分析。

1.5 種子谷蛋白的提取及SDS-PAGE電泳分析

參照曲樂慶等[4]方法提取‘嘉花1號’、突變體以及Lgc-1材料的成熟種子谷蛋白，略加改動。具體步驟：將單粒種子用研缽磨碎，加入1 mL 0.5 mol/L NaCl和10 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，旋渦震蕩混勻，15 000 r/min 離心 10 min，棄上清，將水溶性清蛋白和鹽溶性球蛋白去掉；然后向沉淀中加入1 mL 75%乙醇，旋渦震蕩混勻，15 000 r/min離心10 min，棄上清；再向沉淀中加入0.5 mL 65℃預熱的蛋白抽提液5 mol/L Urea、4%(質量分數，下同) SDS、5% β-ME、20%甘油和0.1 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)，充分旋渦震蕩后室溫靜置過夜。電泳上樣前離心10 min (10 000 r/min)，取10 μL上清進行SDS-PAGE (分離膠15%，濃縮膠7.5%)，恒壓 90 V，垂直電泳270 min左右。電泳后用考馬斯亮藍G-250染色。

2 結果與分析

2.1 GluA3基因特異性表達驗證

通過對‘嘉花1號’編碼谷蛋白的基因GluA3(LOC_Os03g31360)進行測序分析，發現該基因開放閱讀框(ORF)序列與‘日本晴’相同，屬于典型的粳稻材料。為了驗證GluA3基因是否具有胚乳特異性表達，對其植株根、莖、幼葉、倒二葉、劍葉、穗以及授精15d后的未成熟胚乳組織進行轉錄表達分析，結果只在授精15d后的未成熟胚乳中檢測到該基因mRNA轉錄本，并有高表達(圖2A)，這與日本晴基因表達數據庫(http：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP/graph-view.php?featurenum=14894)結果完全一致(圖2B)，證實GluA3基因參與水稻種子中谷蛋白的合成。

圖2 GluA3基因表達的組織特異性Fig.2 The tissue specific expression of GluA3 gene

2.2 CRISPR/Cas9表達載體的構建與轉基因植株獲得

首先通過網址http：//rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search獲得水稻谷蛋白基因GluA3(LOC_Os03g31360)全長cDNA 序列，結合生物信息學網站http：//crispr.dbcls.jp，通過序列比對分析，在第4外顯子上找到一條長度為 19 bp 特異性較好的靶點序列(5’-TCAGGAAGTGCGCGGAAGA-3’)(圖1C)，將其構建到表達載體中(圖1B)，將連接了MH載體的終產物轉入大腸桿菌，在含有卡那霉素的LB固體平板培養基上37℃過夜培養，挑取單菌落并在試管內搖菌過夜。提取質粒，用引物Uctcg-B1 (5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’)和gRcggt-BL (5’-AGCGTGGGTCT-CGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCT-3’)進行PCR擴增，擴增產物進行測序驗證(上海美吉生物公司)，將序列結果正確的質粒轉化農桿菌EHA 105，用于侵染水稻‘嘉花1號’的愈傷組織，獲得組培植株后，利用載體特異性引物HPT-F/R(表1)擴增檢測，獲得陽性轉基因植株23株。

2.3 GluA3基因靶位點突變類型分析

為了檢測23株陽性轉基因植株是否成功編輯，利用GluA3基因序列特異性引物GluA3-F/R(表1)對上述陽性轉基因植株進行擴增測序，發現20個T0代獨立轉基因系在PAM附近位置發生了編輯。進一步將其中的一個T1代植株移栽到試驗田，對GluA3基因測序發現，該基因靶位點突變位點發生分離，M1是在PAM (TGG)第1個堿基(T)至PAM前3個堿基(AGA)共缺失4bp(AGAT)(圖3A)，M2則是在PAM位置前后共缺失45bp (5’-GAAGATGGAATTCTTTCCTGCCATGTGGCTAACCATGGAGTCAGG-3’)，并插入59bp (5’-TTGTGATCATGTTGACATTGAAAACCAACCCTGACTCCATGGTTAGCCACATATGAAGA-3’)(圖3A)。兩種突變均引起編碼的氨基酸發生改變，且翻譯提前終止，影響GluA3蛋白的結構和功能。進一步對T1代28個單株進行DNA提取，用基因序列特異性引物進行PCR擴增和測序分析，通過與‘嘉花1號’(WT)序列比對，發現此突變株為嵌合體，分離出兩種純合突變種(圖3A)；利用特異性引物HPT-F/R進行擴增，發現轉基因載體和基因靶位點在后代中發生了分離(圖3B)；獲得T1代無選擇標記基因突變株。

圖3 CRISPR/Cas9/sgRNA介導的GluA3編輯Fig.3 CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated editing of GluA3

2.4 突變體RNA表達水平以及稻米谷蛋白含量

上述2種類型不包含轉基因載體序列的純合型突變水稻(M1和M2)與‘嘉花1號’表現出相似的植株表型(圖4A)。為了明確基因編輯是否影響GluA3基因的轉錄表達，利用qRT-PCR技術對授精15d后的‘嘉花1號’和突變體未成熟胚乳中GluA3 mRNA表達水平進行比較分析，發現2種突變材料中的GluA3 表達水平均明顯下調，大片段缺失/插入的M2更加明顯(圖4B)，表明GluA3基因第 4外顯子上4個堿基缺失(M1)和大片段缺失/插入(M2)都影響了該基因的轉錄水平。同時，為了明確GluA3基因的突變及轉錄下調是否影響谷蛋白含量以及組分，采用 SDS-PAGE 對‘嘉花1號’、M1和M2水稻糙米種子谷蛋白含量及組分進行了分析。為了提高試驗的可靠性，以低谷蛋白突變體Lgc-1作為對照，結果表明：Lgc-1與‘嘉花1號’相比，22—23 ku和37—39 ku的多肽組分明顯減少[9]，說明本測試方法和結果是可靠的。如圖4C所示，M1和M2谷蛋白含量與‘嘉花1號’相比，表現出明顯下降趨勢，尤其是M2，表明GluA3 突變可引起谷蛋白含量變化。

圖4 ‘嘉花1號’和GluA3基因編輯后代表型、RNA及其谷蛋白表達的檢測Fig.4 Phenotype，expression detection of RNA and gluten of ‘Jiahua 1’，M1 and M2

2.5 GluA3基因編輯后代農藝性狀

為了驗證GluA3突變是否與水稻產量農藝性狀相關，對‘嘉花1號’及其T2代突變體材料的產量相關農藝性狀進行了考察。通過生物統計分析，發現除株高、穗長以及千粒重沒有明顯差異外，穗數、每穗粒數、結實率以及單株產量均存在顯著差異(表2)，突變體材料分別比‘嘉花1號’下降37%、13%、18%和60%以上。

表2 ‘嘉花1號’和突變體水稻農藝性狀的表現

3 討論

CRISPR/Cas9技術是繼RNAi技術、鋅指核酸酶和TALEN核酸酶之后最新發展起來的一種可精確定點編輯基因組DNA的新技術，具有設計構建簡單、快速等優點。該技術首先在動物中廣泛應用，隨后科研人員將其應用于植物基因編輯[20]。目前該技術也已成功應用于水稻分子育種[21]。如沈蘭等[22]敲除中國東北粳稻品種控制粒型大小的GS3基因和每穗粒數的Gn1a基因，發現這2個基因在不同遺傳背景下對產量的影響是多樣的；邵高能等[20]對水稻第8染色體上編碼甜菜堿醛脫氫酶的基因Badh2進行了編輯，獲得香稻材料；周文甲等[23]同時對水稻抽穗期基因Hd2和香味基因Badh2進行編輯，獲得早熟香味水稻品種。本研究也成功地應用CRISPR/Cas9 基因編輯技術對水稻種子谷蛋白GluA3基因進行了編輯，獲得了2種類型谷蛋白GluA3基因的突變體。

通過CRISPR/Cas9技術定點編輯水稻中谷蛋白基因改變谷蛋白含量及其組分，可以改善水稻蛋白品質。如提高稻米谷蛋白含量能提升其營養價值，低谷蛋白品種如‘陽春’、Lgc-1[9]和‘益腎稻1號’能用于腎病患者的食療輔助。本研究在水稻谷蛋白GluA3基因第4外顯子區域設計序列特異性靶位點進行轉基因特異性敲除，成功獲得了GluA3基因的2種突變體材料，這2種突變體材料的GluA3 RNA表達水平均降低，蛋白翻譯提前終止，M1突變體的GluA3 蛋白分子量由原來56.03 ku 變為51.13 ku，而M2突變體變為51.94 ku，導致突變體中GluA3蛋白功能改變，且稻米中谷蛋白含量表現出下降趨勢。目前研究表明，稻米中谷蛋白是由多基因控制，通過對水稻全基因組數據庫(http：//rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice)搜索發現，至少有16個谷蛋白基因(LOC_Os01g55630等)[24]。由此，今后可以進一步利用CRISPR/Cas9技術創制一系列適應市場需求的不同類型谷蛋白含量/組分的稻米新品種。另外，本研究得到2種GluA3突變體(M1、M2)，除了株高、穗長以及千粒重變化不大，其余調查農藝性狀(穗數、每穗粒數、結實率以及單株產量)均受到嚴重負面影響，這可能是GluA3基因一因多效的負作用，也可能是試驗脫靶或組織培養過程中其他基因突變所致，還需進一步探究。本研究后續將對突變體材料與野生型材料進行回交，進一步研究GluA3基因與穗數、每穗粒數、結實率以及產量的關系。