杏鮑菇液體菌種應用工藝參數的優化

王 濤，譚 琦，李 玉，李正鵬，郭力剛，周 峰*

(1 上海海洋大學食品學院，上海 201306； 2 國家食用菌工程技術研究中心，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海市農業科學院食用菌研究所，上海201403)

杏鮑菇(PleurotuseryngiiQuel)是一種廣泛用于工廠化栽培的珍稀食用菌。從20世紀末開始，中國已成為杏鮑菇產量增長最快的國家[1]。2016年我國杏鮑菇產量達到110萬t，產值達65億元(人民幣，下同)，占同期國內食用菌總產量的31%，預計2020年我國杏鮑菇市場規模將達到122億元[1]。目前，我國杏鮑菇栽培企業主要使用固體菌種，質量不穩定；而在食用菌工廠化生產水平較高的韓國，杏鮑菇栽培企業已全部使用液體菌種，品質較好，每年大量出口歐洲和北美等高端市場[2-3]。

液體菌種在我國沒有被廣泛推廣的主要原因之一是發酵條件與工藝技術不成熟[4]。國內對杏鮑菇液體菌種的研究大都停留在實驗室階段，基本是使用三角瓶模擬食用菌發酵罐的生長環境進行相關試驗[5-6]。本研究在引進韓國先進的液體接種機、空氣凈化系統等成套工廠化設備的基礎上，對杏鮑菇液體菌種應用工藝進行系統研究，以期為推廣應用液體菌種技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

杏鮑菇XH菌株，由上海市農業科學院提供。

1.2 主要儀器與設備

韓國液體接種機(D.M.S KOREA公司)，液體菌種300 L發酵罐(上海松仕機械設備有限公司)，無菌空氣過濾系統(上海芹瑞機械設備有限公司與D.M.S KOREA公司提供)，蘑菇滅菌器(連云港國鑫食用菌成套設備有限公司)，出菇房培養調控系統(荷蘭AEM公司)。

1.3 生產工藝流程

液體菌種工廠化栽培流程為：搖瓶培養基制作→搖瓶接種→搖床培養→發酵罐清洗→發酵罐培養基制作→滅菌→冷卻→接種(發酵罐)→菌絲發酵培養(通入無菌空氣)→接種(栽培瓶)→發菌培養→出菇管理。

1.4 無菌空氣產生流程

發酵罐菌絲培養過程中需要通入無菌空氣，無菌空氣產生流程為：外界空氣→空氣壓縮機→儲氣罐→冷凍式干燥機→空氣過濾器→吸附式干燥機→細菌過濾器→減壓閥→空氣過濾膜→發酵罐。

1.5 培養基及菌種培養方法

PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15—20g，水1 000mL，pH自然。

液體培養基：白砂糖20g，豆粕粉3 g，磷酸二氫鉀0.8 g，硫酸鎂0.7 g，水1 000mL。

栽培培養基：木屑45%，玉米芯20%，麩皮15%，米糠15%，玉米粉5%，含水量65%—67%。

液體母種制備方法為：將PDA母種培養基4—5塊(每塊0.5cm2)接種至裝有150mL液體培養基的三角瓶(250mL)中，在22℃下培養，搖床轉速為140r/min，培養時間為7—10d。

液體菌種發酵罐制備：配方同以上液體培養基。先將白砂糖、豆粕粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂在同一容器內加適量水充分溶解混勻，再倒入發酵罐中，定容至250 L，并加入12.5 mL硅酮乳液型消泡劑，121℃滅菌2h，滅菌后立即水淋冷卻。待培養基溫度降至25℃以下時，接入三角瓶中的液體母種。接種時同時通入無菌空氣使發酵罐內保持正壓，然后置于22℃下培養7d。

1.6 栽培瓶接種與出菇管理

將液體菌種發酵罐接種管連接接種機，通氣壓力調節為0.15 MPa。栽培瓶為1 100mL塑料瓶，裝瓶量為750g，滅菌(121 ℃ 2 h)后冷卻至25℃以下接種。接種后的栽培瓶轉入培養室，在20—23 ℃、空氣相對濕度75%、CO2質量濃度2 000—3 000 mg/kg條件下發菌，待菌絲發滿整個栽培瓶5d后進行搔菌出菇。搔菌后的栽培瓶在14—18℃、空氣相對濕度85%—99%、CO2質量濃度1 000—1 500 mg/kg的栽培房內倒扣8d，之后翻轉栽培瓶，使子實體在相同環境中生長、發育。待子實體菌蓋伸展，邊緣略內卷即可收獲。

1.7 發酵罐液體菌種最佳培養條件試驗

通過L9(33)正交試驗，確定最適的通氣壓力、搖瓶母種接種量、培養基初始pH，試驗因素水平見表1。培養7d后，使用韓國液體接種設備連接栽培瓶，接種量22—25g，之后進入菌絲培養與出菇管理階段。

表1 培養條件正交試驗設計

1.8 液體接種栽培瓶接種量試驗

使用1.7節所得出的最佳培養條件，發酵結束后，發酵罐連接接種機進行栽培瓶接種，接種時通氣壓力為0.15 MPa，設定接種機噴射時間分別為0.15s、0.35 s、0.50s、0.65s和0.80s，使接種量產生差異，每處理48個重復。記錄發滿瓶所用的時間，后熟10d后搔菌，進行出菇試驗。

1.9 最佳后熟時間試驗

采用以上最佳培養條件與接種量，在栽培瓶發滿菌絲后的1—19d內，每天取48瓶進行搔菌，進行出菇試驗，記錄每瓶的產量。

1.10 液體菌種與固體菌種對比試驗

采用以上得到的最佳發酵條件、最佳接種量、最佳后熟時間等進行出菇試驗，并與固體菌種生產進行對比。

2 結果與分析

2.1 液體菌種最佳培養條件試驗

由表2可見，以菌絲發滿瓶所用的時間為指標，菌絲發滿瓶越快，培養期越短，即可以減少生產與管理成本。極差分析表明，影響因素大小依次為接種量>pH>通氣壓力，最佳培養條件組合為接種量150mL、通氣壓力0.050 MPa、初始pH 6.3。

表2 發酵罐液體菌種培養條件正交試驗結果

2.2 最佳接種量試驗

接種機噴射時間為0.15 s、0.35 s、0.50 s、0.65 s、0.80 s對應的栽培瓶接種量分別為11 g、18 g、24 g、33 g、45g。由表3可見，當接種量變大時，菌絲發滿瓶所用的時間也會變短，接種噴射時間為0.65s和0.80s的處理與0.15s、0.35s、0.50s處理的菌絲發滿瓶時間有顯著或極顯著差異，這可能是因為接種量越大，液體菌種與培養料的接觸點就越多，從而使發菌點增多。但從單瓶產量來看，接種量過大(0.65s、0.80s)時，產量下降并與其他接種量的產量有極顯著差異。這可能是由于接種量過大，使培養基含水量超過最佳含水量的范圍，從而影響了產量。綜上，接種機噴射最佳時間為0.50s。

表3 接種機最佳接種量試驗結果

注：LSD法進行多重比較分析，同行不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)

2.3 最佳后熟時間試驗

如圖1所示，過短的后熟時間會影響杏鮑菇的產量，隨著后熟時間的延長，菌絲吸收養分和水分增多，產量相應提高，從第6天開始產量趨于穩定，每瓶在160g以上，但后熟時間過長，菌絲老化，從第15天開始，產量緩慢下降。從節能的角度考慮，培養時間越短，培養房消耗的能量越少，周轉越快，因此建議在后熟第6—15天根據實際生產情況安排搔菌出菇。

圖1 單瓶產量隨后熟時間變化情況Fig.1 Changes of yield per bottle along with after-ripening time

2.4 液體菌種與固體菌種對比試驗

如表4所示，液體菌種發滿瓶時間比固體菌種快近6d，具有極顯著差異，但出菇時間上沒有表現出優勢；產量上液體菌種比固體菌種有所提高，具有顯著差異。液體菌種每瓶菇的個數多于固體菌種，子實體平均質量小于固體菌種，通常每瓶子實體為2—3個時有利于工廠化瓶栽杏鮑菇的利潤最大化[7]，因此在液體菌種的應用中需要注重控制出菇子實體個數的技術研發。液體菌種在菇型方面(包括全長、柄長、蓋徑、柄徑等)與固體菌種無顯著差異。

表4 液體菌種與固體菌種出菇試驗比較

注：LSD法進行多重比較分析，同列“**”、“*”分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)

3 討論

本研究使用液體菌種發酵罐和韓國先進的液體接種機等設備，在工廠化栽培條件下，確定了杏鮑菇液體菌種發酵罐最適的接種量、通氣壓力、初始pH以及最佳接種時間。接種量和通氣壓力的增加有助于側耳屬菌絲體內多糖和二糖的合成，促進菌絲生長[8]。本研究得出接種機噴射時間為0.50s時可以得到最佳的接種量，此接種量可以使菌種在栽培瓶內達到較快的生長速度，又不會導致瓶內培養料含水量過高而影響出菇。試驗表明，菌絲發滿瓶的速度與接種量成正相關，但接種量過大產量反而下降，或許是因為含水量過大引起的[9]。在實際生產中，當裝瓶攪拌過程中培養基含水量較低時，可通過增加接種過程的液體接種量來補充培養基水分，但栽培料攪拌過程中加水與接種時加水物理特性可能會有不同。韓國有研究指出，可通過改變配方來改善培養基物理特性或營養特性，提高貨架期和產量[10]，也可以通過改進機械設備促進培養基對菌液的吸收[11]，這些工藝都有待進一步探索并應用于生產。

本試驗中，最佳后熟時間是6—15d。有研究認為，后熟可使菌絲體生長達到所需的積溫[12-13]，本試驗杏鮑菇生長溫度為21℃，若提高環境溫度使菌絲生長較快地達到所需的積溫，可減少后熟時間。但環境溫度的提高也有可能引起“燒菌”[14]，因此液體菌種的后期栽培工藝也可以進一步優化。近年的生產實踐和研究表明，出菇期溫濕度精細管控對杏鮑菇產量有顯著的影響[15-16]。

綜上，本研究對杏鮑菇液體菌種應用工藝參數的優化可為進一步推廣其生產提供指導。