星點設計-響應面法優化鬧羊花中二萜的提取工藝△

孫婧，吳建華，宋藝君，戴洋

陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046

鬧羊花RhododendronmolleG.Don是著名有毒的杜鵑花屬植物[1]，其毒性成分主要包括梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素等二萜類化合物[2-3]。近代研究表明，二萜類化合物在抗腫瘤、抗菌、抗病毒等方面具有重要的醫用價值[4]。而目前主要的提取工藝為乙醇回流法[5]，但此法對樣品處理時有一定的局限性，如效率低下、受熱時間長、活性組分易被破壞等[6]。

隨著超聲技術的不斷發展，超聲波提取工藝由于成本低、效率高、周期短等優勢[7]，在藥物、食品等學科門類中應用廣泛[8-9]。針對超聲波提取二萜類物質文獻報道甚少，因此本文采用該法提取鬧羊花中總二萜物質，并結合星點設計法[10]對其工藝進行了優化，得到了最佳的工藝條件。這既可作為提取鬧羊花中同類物質的參照，又可為擴大實際生產提供一定的技術支持和參考價值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HP1100高效液相色譜儀(北京吉星達成科技有限公司)；KQ-50E型超聲波清洗器(廣州君達儀器儀表有限公司)；BP211D電子天平(德國Sartorius)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(河南天帝電子科技有限公司)；FW200型高速萬能粉碎機(北京成萌偉業科技有限公司)。

1.2 試藥

對照品梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素由西北大學化工學院白乃生教授提供，純度大于99%；水為雙蒸水；乙醇；其余試劑均為分析純。

鬧羊花藥材，購于河北省某醫藥原料市場，經白乃生教授鑒定為鬧羊花RhododendronmolleG.Don的花。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

分別稱取梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素對照品適量，然后加入60%(v%，下同)的乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，分別制成梫木毒素(質量濃度為1.926 mg·mL-1)、木藜蘆毒素(質量濃度為2.202 mg·mL-1)、鬧羊花素(質量濃度為2.173 mg·mL-1)的對照品混合溶液備用。

2.2 樣品制備及提取實驗

影響鬧羊花二萜類化合物提取工藝的因素主要有溶劑種類、溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數。

理想且最為常用的溶劑種類包括甲醇、乙醇、丙酮等。而甲醇和丙酮有一定的毒性，因此選擇乙醇作為提取鬧羊花二萜類物質的溶劑，并結合相關研究[11]選擇了60%的乙醇溶液。

將鬧羊花用粉碎機打碎后過40目篩，精密稱取粉末0.5 g，置于帶塞的錐形瓶中，加入60%乙醇25 mL。因提取次數為非連續變量，結合實際工業化生產，固定為2次[12]。在常規乙醇回流法和乙醇超聲法兩種工藝下各提取30 min，通過3組不同工藝的對比實驗確定最佳的提取方法，結果見表1。然后設置不同的料液比、提取溫度和提取時間進行單因素試驗。最后經0.45 μm微孔膜過濾后取1 mL溶液，用60%乙醇定容于10 mL容量瓶中備用。

表1 不同提取方法對二萜提取量的影響 mg·g-1

由表1可知，采用常規乙醇回流法所得的鬧羊花中二萜提取量低于乙醇超聲工藝所得。這是因為超聲波是一種彈性波，振動產生較大的能量，有助于乙醇和二萜物質的傳質過程，最終增加了二萜的提取量[13]。因此選用乙醇超聲法作為最佳的提取工藝。

2.3 標準曲線繪制

采用液相色譜法得到了測定梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素含量的回歸方程，分別為Y1=37.14X1-2.18，r=0.999 9；Y2=62.39X2-4.26，r=0.999 8；Y3=56.82X3+1.35，r=0.999 9。擬合的相關系數r值均較高，可用于后續的分析測定。

2.4 精密度試驗

取對照品溶液于1 d內連續進樣5次，計算梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素的峰面積，計算RSD(n=5)分別為1.64%、1.17%、0.59%。

2.5 重復性試驗

精密稱取鬧羊花粉末5份，制備樣品溶液，測定峰面積，計算RSD(n=5)值分別為1.53%、1.15%、0.41%。

2.6 穩定性試驗

取2.2.5的樣品溶液，分別在0、3、6、9、12、24 h進樣，記錄峰面積并計算RSD值為2.2%，表明供試樣品在24 h內保持穩定。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知總二萜類化合物含量的同一鬧羊花粉末5份，每份0.5 g，各加入對照品溶液中含量相當的溶液，梫木毒素、木藜蘆毒素和鬧羊花素的對照品按2.1制備，結果測得平均回收率為104.83%(n=5)。

3 二萜類化合物收率及含量測定

3.1 二萜類化合物含量測定

取2.1所得濾液，測定二萜類化合物的含量。

3.2 二萜類化合物收率測定

將2.1濾液濃縮后真空干燥，得浸膏粉，然后按照式(1)計算含量。

(1)

式中：Y表示二萜類化合物含量；C為總二萜類化合物質量濃度；V為提取液體積；m為樣品質量。

4 結果

4.1 單因素試驗

4.1.1 料液比對二萜提取量的影響 固定提取溫度為50 ℃，提取時間為40 min，研究不同料液比對二萜物質提取量的影響規律，結果見圖1。

圖1 料液比對二萜物質提取量的影響

由圖1可知，提取的二萜物質提取量隨溶劑乙醇用量的增大呈先增后減的趨勢。當料液比為1∶40時，二萜物質的提取量達到最大。這是因為當乙醇用量較小時，二萜物質的提取量小，而乙醇用量過大時，提取出的二萜物質可能部分被溶解破壞，導致含量略有降低。

4.1.2 提取溫度對二萜提取量的影響 固定料液比為1∶40，提取時間為40 min，研究不同提取溫度對二萜物質提取量的影響規律，結果見圖2。

圖2 溫度對二萜物質提取量的影響

由圖2可知，二萜物質的提取量隨溫度的升高呈增大的趨勢，但增加趨勢逐漸減小。當提取溫度為60 ℃時，二萜物質提取量為59 mg·g-1，而當溫度為70 ℃時二萜提取量僅增加了0.5 mg·g-1。由此可以看出，當溫度高于60 ℃時，繼續增加溫度，對于二萜物質提取量的增加并沒有實質性作用，且當溫度過高時，對于二萜類物質也會造成一定的影響，綜合分析適宜的提取溫度為60 ℃。

4.1.3 提取時間對二萜提取量的影響 固定料液比為1∶40，提取溫度為60 ℃，研究不同的提取時間對二萜物質提取量的影響規律，結果見圖3。

圖3 時間對二萜物質提取量的影響

由圖3可知，二萜物質的提取量隨提取時間的增大呈先增后減的趨勢。當提取時間為40 min時，二萜物質提取量達到最大值59 mg·g-1，此后隨著時間的增加，二萜物質提取量逐漸減小，這可能是由于時間過長，溶出了更多的雜質，降低了二萜物質的提取量，這也與成英等[14]研究類似，因此適宜的提取時間為40 min。

4.2 星點設計優化工藝

為了得到最佳的鬧羊花二萜類化合物提取工藝，采用星點設計-響應面優化法對其進一步優化，所用軟件為Design-Expert8.0。以料液比X1、提取溫度X2、提取時間X3為因素，以二萜提取量Y為響應值，設計三因素五水平試驗方案。根據星點設計規則，任意兩個物理量的差值與對應代碼之間成等比的原則，水平編碼分別取±1.68、±1和0，因素水平見表2。實驗方案設計及結果見表3，實驗方差分析見表4。

表2 星點設計各因素水平

表3 星點設計方案和結果

表4 方差分析表

由星點設計試驗經響應面二次模型分析法得到了料液比X1、提取溫度X2、提取時間X3對二萜提取量Y的回歸方程：

Y=63.68+0.15X1+5.00X2+0.33X3+

0.40X1X2+0.47X1X3+0.27X2X3-

由表4可看出，所擬合的模型方程顯著性小于0.000 1，說明上述回歸方程極為顯著。失擬誤差均大于0.05，說明不存在失擬因素。所以完全可以利用此回歸模型代替真實的實驗點來進行數據的比對和分析，結果亦是合理和可靠的。一次項系數X2的顯著性小于0.000 1，表現差異有統計學意義，但X1和X3的顯著性大于0.01，表明對二萜提取量影響不顯著，這是由于料液比和提取時間增大時，二萜類物質的提取量達到了極限，此時二萜物質幾乎完全被提取出，因此相較于提取溫度而言表現不顯著。此外由F值和顯著性的大小可知，對浸膏得率和二萜提取量影響因素的大小順序均為：提取溫度>提取時間>料液比。

根據實驗結合星點設計結果，得到各因素間交互作用的三維空間曲面圖和等高線圖，見圖4。

響應曲面的起伏高度顯示了各因素對響應值的影響大小，其關系成正比。即曲面起伏高度越陡，該因素對響應值影響越明顯。等高線密集成橢圓表示兩因素交互作用大，而成圓形時表明交互作用小。所以通過圖4的比較，對二萜提取量影響最大的因素是提取溫度，最小的為料液比。這與上述方差分析表得出的結論也是一致的。

通過對各因素的優化，得到了最佳的鬧羊花二萜類化合物提取工藝條件：料液比為1∶40.29，提取溫度為63.15 ℃，提取時間為40.53 min。預測最大的鬧羊花二萜提取量為65.27 mg·g-1。

4.3 可靠性驗證

為了驗證星點設計試驗的可靠性，考慮到實際情況，微調了最佳工藝，進行3組驗證試驗，得到了鬧羊花二萜提取量分別為63.92%、64.78%和62.85%，這與星點設計預測值的相對誤差在5%以內，說明了星點設計試驗方案可靠，結果較為準確。

5 結論

采用星點設計-響應面法對鬧羊花中二萜物質的提取工藝進行了優化，得到了鬧羊花二萜的最優提取工藝條件：料液比1∶40.29，提取溫度63.15 ℃，提取時間40.53 min。預測最大的鬧羊花二萜提取量為65.27 mg·g-1，并通過實驗驗證了星點設計方案的合理性與可靠性。所以該工藝條件既可為后期提取鬧羊花中同類物質作參照，又可為擴大實際生產提供一定的技術支持和參考價值。

注：A.料液比和提取溫度對二萜提取量的交互作用；B.料液比和提取時間對二萜提取量的交互作用；C.提取溫度和提取時間對二萜提取量的交互作用。圖4 各因素交互作用三維曲面圖