海南東寨港海水和沉積物中抗生素抗性基因污染特征研究

姜春霞 ，黎 平 ，李森楠 ，刁曉平, *，黃 煒 ，王道儒，葉翠杏

1. 海南大學熱帶農林學院，海南 海口 570228；2. 海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228；3. 熱帶島嶼生態學教育部重點實驗室，海南 海口 571158；4. 海南省海洋與漁業科學院，海南 海口 570125

抗生素作為養殖業防治細菌性疾病和刺激生長的重要助力，常作為防病藥物及飼料添加劑而被廣泛應用于水產養殖中。有研究報道，抗生素被攝入動物體內后，有近85%以上的原藥會隨著動物糞便或尿液排除體外，進入自然環境（Hartmann et al.，1998）。殘留在環境中的抗生素會對環境中微生物產生選擇壓力，從而誘導抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）產生。ARGs可以通過轉座子、質粒等可移動遺傳元件（Mobile Genetic Elements，MGEs）在不同菌株之間進行水平轉移（Gogarten et al.，2005；Schlüter et al.，2007），從而使得更多微生物獲得抗生素抗性。相關研究表明，在使用過抗生素的養殖環境中，攜帶ARGs的耐藥性菌株的種類和數量日益增加，ARGs將通過食物鏈最終進入人體，這將給人類健康帶來風險隱患。Pruden et al.（2006）認為ARGs是一種新型污染物，世界衛生組織（WHO）也已將 ARGs列為21世紀威脅人類健康的最重大挑戰之一（王麗梅等，2010)，其污染問題也越來越受到人們的關注。

針對磺胺類、四環素類、氯霉素類、喹諾酮類抗生素的耐藥菌通常攜帶有一種或多種耐藥機制的ARGs。包括介導藥物靶位點改變機制的基因 sul1、sul1、dfrA1，介導抗生素外排機制基因cmle1、cmle3、tetA、tetC、tetG，介導藥物靶位點保護機制基因tetM、qnrS，介導藥物活性位點失活的耐藥基因cata1、cata2。這些基因在人體、畜禽及多重環境介質分離菌中均被定性檢出（李壹等，2016）。研究表明，水產養殖是ARGs的重要來源，許多ARGs在中國乃至世界各地的水產養殖環境或飼養對象中都有檢出（Muziasari et al.，2016；Stalin et al.，2016）。然而，目前的研究大多針對畜禽及淡水水產養殖環境中抗生素及ARGs的檢測（Wang et al.，2016；Qian et al.，2017；Czekalski et al.，2014；Harnisz et al.，2015；Marti et al.，2018），而對海水水產養殖環境關注較少。

海南省抗生素排放在中國處于中等偏高水平（Zhang et al.，2015），抗生素的高水平排放將會給當地生態環境帶來挑戰。東寨港位于海南省東北部，是國家級紅樹林濕地自然保護區，已列入世界重要濕地保護名錄，具有重要的生態及經濟價值。同時，東寨港海水養殖區是海南重要的灘涂養殖基地，其周邊陸地區域也存在大量的養殖塘，該區域抗生素及其引起的ARGs污染不容小覷。在以往的研究中，有關該區域抗生素及ARGs的研究未見報道。基于此，本研究將對該區域抗生素及ARGs進行調查，具體內容包括：（1）分析沉積物和海水中12種 ARGs的豐度、分布特征及；（2）16種抗生素的殘留狀況；（3）比較東寨港海水和沉積物中ARGs的分布差異；（4）初步分析ARGs豐度與抗生素殘留的關系。本研究旨在為規范當地水產養殖管理和評估生態環境現狀提供數據基礎。

圖1 采樣點分布圖Fig.1 Location of sampling sites

1 材料與方法

1.1 樣品采集

東寨港形似漏斗，屬溺谷型港灣，海岸線總長84 km，灘涂水域面積5400 hm2（李仕平等，2017）。本研究于2016年6月進行樣品采集，采樣點如圖1所示，共設置 10個采樣點（S1－S10），采集海水和沉積物樣品。其中，S1靠近內陸；S2－S5淺海區域均有灘涂養殖區，且周圍海岸均存在養殖塘；S6、S7靠近養殖塘；S8、S9靠近鋪前碼頭；S10靠近外海，是鋪前出海要塞。采樣區域由內港向入海口方向延伸，可完整呈現該區域內港至外港抗生素及ARGs的污染趨勢及水平。使用采水器采集表層0－0.5 m海水并裝入滅菌采樣瓶中；用采泥器采集表層沉積物并裝入鋁盒（121 ℃濕熱滅菌）中；所采集樣品用于ARGs及抗生素檢測。樣品采集完畢后立即運回實驗室，水樣于4 ℃冷藏，沉積物于-20 ℃保存，盡快進行樣品處理。

1.2 抗生素的檢測

本研究對東寨港沉積物及海水中4類15種抗生素（磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺吡啶、磺胺異惡唑、四環素、金霉素、土霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星）進行檢測，檢測方法及分析條件如下：

1.2.1 沉積物抗生素檢測

將沉積物樣品冷凍干燥48 h，過0.30 mm孔徑篩，準確稱取2 g沉積物至錐形瓶中，向錐形瓶中加入 V(甲醇)：V(EDTA-Mcllvaine緩沖液)=1∶1 混合液（10 mL），振蕩30 min，超聲提取10min，靜置，收集提取液。殘渣用上述方法反復提取兩次，合并提取液。將提取液進行旋轉蒸發（水浴40 ℃）、濃縮至約10 mL。將LC-SAX（500 mg/3 mL）與LC-18（500 mg/3 mL）進行串聯，固定在萃取儀上，萃取富集。用3 mL甲醇（色譜純）洗脫LC-18小柱，收集洗脫液。氮吹濃縮洗脫液至近干。用流動相95%A[0.1%甲酸(1∶1，V/V)-1 g·L-1甲酸銨水溶液]和5%B[甲醇-乙腈(1∶1，V/V)]定容至 1 mL，過 0.22 μm尼龍濾膜，待測。

1.2.2 海水抗生素檢測

取1 L已過濾水樣，用鹽酸-水溶液（1∶1，V/V）調節pH至2.5。依次用20 mL甲醇、6 mL超純水、6 mL鹽酸對SPE柱進行活化。用已活化的SPE柱對水樣進行富集，流速控制在 10 mL·min-1左右。富集完成后用氮氣輕柔吹干富集小柱，將氮吹干燥后的小柱與填有無水硫酸鈉的小柱串聯，用 6 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液氮吹（水浴40 ℃）濃縮至近干。用流動相95%A和5%B定容至1 mL，過0.22 μm尼龍濾膜，待測。

1.2.3 抗生素分析條件

色譜柱為：ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm，美國waters公司）；進樣量：10 mL；柱溫：40 ℃；流速為0.30 mL·min-1。流動相A為含0.2%甲酸銨的超純水；流動相B為含有甲醇和乙腈的混合物（1∶1，V/V）。梯度洗脫程序為：起始5% B 3 min，然后在18 min內從5% B線性變化至88% B。質譜離子源為：ESI+/ESI-切換，MRM數據采集模式。

本研究采用外標法對抗生素進行定量，用流動相配制一系列不同濃度的混合標準液進行測定。標準曲線以抗生素濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，所得標準曲線判定系數均在0.998之上。水樣中抗生素的回收率為71.6%－112%，檢出限范圍為0.10－4.20 ng·L-1。沉積物中抗生素的回收率為 62.1%－95%，檢出限范圍為0.12－6.3 ng·g-1。

表1 實驗所用序列及PCR反應條件Table1 Sequence of primer and condition of PCR reaction in this study

1.3 樣品總DNA的提取

1.3.1 沉積物

每個樣點設置3個生物學重復，每個重復稱取0.25－0.35 g新鮮樣品，采用 PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒（MoBio，美國）進行沉積物總DNA提取，所得DNA用NanoDrop 2000微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）測其含量及純度。DNA樣品于-80 ℃下保存備用。

1.3.2 海水

于24 h內將獲得的水樣依次過8 μm、5 μm無菌濾膜以除去雜質，之后用0.22 μm濾膜過濾并收集濾膜，用無菌鋁箔包裹，-20 ℃下保存。用液氮將濾膜研磨成粉末狀，用PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒（MoBio，美國）提取總DNA，并使用NanoDrop 2000微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）測定DNA含量及純度。DNA樣品于-80 ℃下保存備用。

1.4 質粒制備

選取 ARGs（sul1、sul2、dfrA1、tetA、tetC、tetG、tetM、cata1、cata2、cmle1、cmle3、qnrS）和16s rRNA作為目的基因，引物設計詳見表1。對樣品中12種ARGs目的片段進行PCR擴增，同時進行空白試驗。擴增體系為：14.5 μL Green Master Mix，上下游引物各1.5 μL，2 μL DNA模板（質量濃度范圍：10－50 mg·L-1），5.5 μL 無酶水。擴增條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，退火溫度（見表1）30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工，上海）對正確的片段進行膠回收。將目的基因連接到PGEM-Teasy載體后導入商品化感受態Trans5α（全氏金，北京）進行克隆。每個平板挑選 40個克隆子進行培養。裂解細菌，使用SanPrep柱式質粒提取試劑盒（生工，上海）進行質粒抽提。抽提得到的質粒使用微量分光光度計測其濃度，保存于-80 ℃下備用。

1.5 RT-PCR

利用一系列稀釋后的質粒作為 RT-PCR模板DNA測定其每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數（Cycle threshold，tC），以拷貝數對數作為橫坐標，tC值作為縱坐標構建標準曲線。RT-PCR 反應體系為：5 μL SYBR Green Master Mix，上下游引物（表1）各0.5 μL，2 μL DNA模板（質量濃度范圍：10－50 mg·L-1），2 μL 無酶水。反應條件為：95 ℃預孵育10 min，95 ℃變性30 s，退火溫度（表1）30 s，共45個循環。溶解條件為：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s。拷貝數計算公式如下：

式中，C0為質粒初始濃度；C為質粒拷貝數（copies·g-1或 copies·μL-1）；3015 為 PGEM-Teasy載體長度；L代表目的基因長度。

標準曲線結果顯示判定系數R2均大于0.99，線性關系良好，可用于各 ARGs拷貝數計算。使用RT-PCR對樣品中12種抗性基因和16S rRNA進行絕對定量。將樣品得到的tC值帶入標準曲線，最終計算出基因絕對豐度。

基因豐度表達有兩種表達方式：絕對豐度、相對豐度。絕對豐度表示目的基因在某一環境介質中的含量；而相對豐度表示目的基因的絕對豐度相對于內參基因16S rRNA的變化，可定量表示抗生素對ARGs的誘導率（冀秀玲等，2011），同時ARGs的相對豐度更能反映ARGs在樣本中的分布狀況。相對豐度計算如下：

式中，Ar為抗性基因相對豐度；Aa為抗性基因絕對豐度；Aa-16SrRNA為16S rRNA基因絕對豐度。

1.6 數據統計

所有數據運用SPSS 17.0進行統計分析，采用t檢驗及One-way ANOVA進行差異顯著性分析，采用Pearson相關性分析法分析ARGs間或ARGs與抗生素間的相關性。

2 結果

2.1 抗生素殘留情況

2.1.1 海水中抗生素的殘留及分布

本研究 10個采樣點總抗生素質量濃度范圍為0.168－12.963 ng·L-1。不同點位抗生素質量濃度高低順序為：S4 (12.963 ng·L-1)＞S5 (7.545 ng·L-1)＞S3(6.619 ng·L-1)＞S2 (6.274 ng·L-1)＞S7 (5.368 ng·L-1)＞S9 (5.300 ng·L-1)＞S1 (4.910 ng·L-1)＞S6 (4.460 ng·L-1)＞ S8 (3.828 ng·L-1)＞S10 (0.168 ng·L-1)。15 種抗生素中有 5種抗生素（諾氟沙星、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺吡啶、磺胺異惡唑）被檢出，檢出率分別為 70%、80%、100%、60%、20%。其中諾氟沙星質量濃度范圍為 ND（未檢出）－6.170 ng·L-1；磺胺二甲基嘧啶質量濃度為 ND－0.925 ng·L-1；磺胺甲惡唑質量濃度范圍為 0.168－5.735 ng·L-1；磺胺吡啶質量濃度范圍為 ND－0.375 ng·L-1；磺胺異惡唑質量濃度范圍為ND－0.133 ng·L-1。

2.1.2 沉積物中抗生素的殘留及分布

沉積物抗生素檢測中，各樣點總抗生素質量濃度范圍為 ND－1.240 ng·L-1，其中 S5（1.240 ng·L-1）質量濃度最高，S1、S7、S8（低于檢出限）最低。15種目標抗生素中，僅有磺胺吡啶、磺胺異惡唑兩種抗生素被檢出，檢出率分別為50%、60%，其濃度范圍分別為 ND－0.6、ND－0.64 ng·g-1。

2.2 ARGs豐度及分布特征

2.2.1 海水中ARGs豐度及分布特征

海水中ARGs及16S rRNA絕對豐度及分布特征見圖2a。由圖可以看出，海水∑ARGs、16S rRNA絕對豐度分別為 8.68×103－1.37×109copies·L-1、1.01×1010－1.37×1011copies·L-1；∑ARGs相對豐度為 8.57×10-7－3.45×10-2，最高∑ARGs 相對豐度（3.45×10-2）出現在S4號采樣點，S3次之（2.68×10-2），S10 最小（8.57×10-7）。在 12 個 ARGs中，sul1、sul2、dfrA1、tetA、tetC、tetG、tetM、cata2、cmle1、cmle3檢出率為90%，cata1檢出率為80%，qnrS檢出率為100%，在樣點S10處僅有qnrS被檢出。在海水樣品中，sul2絕對豐度最高（5.13×108copies·L-1），sul1 次之（1.21×108copies·L-1），tetM最低（1.16×105copies·L-1）。

2.2.2 沉積物中ARGs豐度及分布特征

沉積物ARGs絕對豐度以樣品干重進行計量，詳見圖2c。由圖可知，沉積物中∑ARGs和16S rRNA絕對豐度分別為 1.13×108－5.34×108copies·g-1、1.33×109－1.24×1010copies·g-1；ARGs 相對豐度為1.57×10-2－1.08×10-1。由圖 2c、圖 2d 可知，各 ARG在沉積物樣品中均有檢出，且檢出率為 100%，說明檢測的 ARGs在沉積物樣品中廣泛存在。ARGs含量水平表現為：磺胺類抗性基因＞氯霉素類抗性基因＞四環素類抗性基因＞喹諾酮類抗性基因，其中sul2豐度在所有采樣點中均為最高，絕對豐度高達5.05×107－2.17×108copies·g-1，cmle3 次之，絕對豐度為 2.73×107－1.40×108copies·g-1。

3 討論

3.1 東寨港抗生素含量水平及分布

各檢出抗生素質量濃度差異不明顯（P＞0.05）。與高橋紅樹林區（Li et al.，2016）、渤海灣（Zou et al.，2011）及珠江（He et al.，2012)、漢江（Hu et al.，2018）相比，東寨港抗生素的質量濃度及檢出率都處于較低水平。這可能與東寨港區域抗生素間斷性輸入有關，同時，抗生素自身性質也可能是重要原因之一，比如磺胺類及喹諾酮類抗生素具有光敏感性（Thiele-Bruhn，2003；Park et al.，2002）而四環素類抗生素存在吸附-解析行為（Tenenbaum et al.，2014）。

抗生素在海水和沉積物中的殘留量均表現為內港區域高于臨海區域，這可能與內灣區域海水養殖和養殖塘排污有關；對各點抗生素質量濃度進行差異分析發現，各采樣點抗生素的污染差異不明顯（P＞0.05）。此外，海水中抗生素殘留量高于沉積物，可能與抗生素的水溶性有關。

3.2 東寨港ARGs污染分析

3.2.1 海水中ARGs豐度及分布特征分析

內港區域∑ARGs絕對豐度高于入海口。利用One-way ANOVA對海水中不同點ARGs進行比較分析，發現各采樣點之間并無顯著性差異（P＞0.05），這可能是當地海水頻繁交替而加速各樣點微生物擴散導致的。采用相對豐度進行比較分析，發現東寨港的sul1、sul2檢出豐度（圖2b）比山東地區海水養殖區高（李壹等，2016），與海河河水檢出豐度相近（Luo et al.，2010），說明該地受到了磺胺類抗生素抗性基因的污染。高拷貝數的sul1和sul2可能是微生物受到磺胺類藥物誘導產生的，同時也與 sul基因在環境中代謝速度慢有關（Mckinney et al.，2010）。此外，sul1經常與一類整合子結合在一起（Sk?ld，2000），兩者之間的緊密關系也可能是sul1基因表現出高豐度的原因之一。

3.2.2 沉積物中ARGs豐度及分布特征分析

就絕對豐度而言，內港區域∑ARGs豐度高于入海口區域；而相對豐度呈現相反的趨勢（圖2c、圖2d）。內港區域高水平的ARGs絕對豐度可能與該區域大面積的海水養殖有關；而其較入海口區域低的相對豐度說明內港ARGs在微生物群落中的表達低于入海口區域。對沉積物中不同采樣點 ARGs進行差異分析，發現各采樣點間的ARGs豐度差異并不明顯（P＞0.05），這可能與該區域抗生素的污染源分布及當地頻繁的水流交換有關。與長江口（Guo et al.，2018）和北江流域（Ling et al.，2013）的研究結果相比，東寨港沉積物中ARGs豐度較高，與灞河相當（Jia et al.，2018）。在研究區域，磺胺類抗性基因（sul1、sul2）含量較其他基因處于較高水平，這與珠江水產養殖區調查結果一致（梁惜梅等，2013）。sul1和 sul2的高水平表達，說明這兩種基因的宿主菌對各種環境的耐受能力強，從而促進了這兩種基因在環境中的擴散與傳播。

本研究表明，東寨港海水和沉積物均受到12種ARGs的影響，與前人研究相比，其豐度處于較高水平。氯霉素是一類廣譜性藥物，曾被廣泛用于畜牧和水產養殖行業，而由于其具有誘發再生障礙性貧血癥和致畸等強毒副作用（Turton et al.，2000），中國已于1999年禁止此類抗生素藥物在水產養殖行業的使用。但近年來氯霉素乙酰轉移酶類耐藥基因（cata1、cata2）及編碼氯霉素外排泵蛋白類基因（cmle1、cmle3）在海水養殖區仍屢屢被檢出（Hu et al.，2008；李壹等，2016），說明歷史背景誘導產生的 ARGs仍廣泛存在于養殖環境中。在東寨港海水和沉積物中氯霉素類抗性基因（cata1、cata2、cmle1、cmle3）分布極為廣泛，與山東地區海水養殖區相比（李壹等，2016），該區域氯霉素類抗性基因相對豐度較高。四環素外排基因（tetA、tetC、tetG）及核糖體保護外排基因（tetM）常常在海水養殖環境及自然環境水體中被檢出（Ling et al.，2013；Luo et al.，2010；Mackie et al.，2006），同時也廣泛存在于東寨港區域。在東寨港海水和沉積物中，tetC基因含量均比其他四環素類抗性基因豐度高，這一結果與對洪澤湖的研究結果相似（羅方園等，2017）。此外，喹諾酮類抗生素是近年來使用的一類抗生素類藥物，但喹諾酮類耐藥菌已在多種環境中被檢測到。喹諾酮類抗性基因（qnrS）東寨港海水和沉積物中檢出率均為100%，其帶來的污染不容小覷。

3.2.3 海水和沉積物中ARGs差異分析

采用t檢驗對兩種介質中ARGs進行比較分析，發現兩者之間存在明顯的差異（P＜0.05），其中沉積物的ARGs豐度顯著高于海水。這說明抗性基因在沉積物樣品中的污染比海水嚴重，即沉積物中ARGs在微生物群落中的表達高于海水。這一現象可能與沉積物對污染物的強貯存能力和海水的強擴散能力有關，同時也可能與沉積物中較為活躍的微生物基因交流有關。東寨港生態環境復雜，為全面了解當地污染情況，還需進一步研究驗證。

圖3 海水及沉積物中ARGs絕對豐度及抗生素含量的相關分析Fig.3 Correlation analysis of ARGs in seawater and sediment.

3.3 海水/沉積物中ARGs、抗生素相關性分析

對東寨港海水/沉積物中ARGs進行相關性分析，結果如圖3。海水中SA與∑ARGs之間存在顯著的相關性（r=0.990，P＜0.01）；海水中16S rRNA與sul1和 drfA1均存在顯著相關性（r=0.882和 0.799，P＜0.01），而與其他基因相關性較弱。在沉積物中，介導抗生素外排機制基因tetC、cmle1、cmle3兩兩之間存在顯著相關性（r=0.731－0.958，P＜0.01或P＜0.05）。忽略ARGs的作用機制不談，在海水樣品中，sul1、sul2、tetA、tetG與∑ARGs、SA之間顯著相關（r=0.657－0.976，P＜0.1或P＜0.05）。沉積物中sul1及sul2分別與另外5種ARGs（tetC、tetM、cata1、cmle1、cmle3）存在顯著相關性（r=0.674－0.964，P＜0.01或P＜0.05）。此外，sul1、sul2、tetC、tetM、cata1、cmle3與∑ARGs、SA、TA、CA 均存在顯著或極顯著相關性（r=0.756－0.997，P＜0.01或P＜0.05），∑ARGs、SA、TA、CA兩兩之間呈極顯著相關（r=0.838－0.986，P＜0.01）。根據以上分析結果可知，東寨港海水/沉積物中不同或相同類別的ARGs之間都可能存在相關性，這與灞河的結果類似（Jia et al.，2018），而抗生素產生的選擇壓力和 ARGs在環境中的轉移機制可能是導致這一現象的重要原因。為更全面了解各ARG之間的關系，進一步研究環境中ARGs的轉移機制十分有必要。

對已檢出的不同類型的抗生素分別進行加和統計，并與ARGs進行相關性分析，結果如圖3所示。抗生素與ARGs之間相關性較弱（P＞0.05），這可能與抗生素的物理化學性質及ARGs在環境中的轉移機制有關（Jia et al.，2018）。此外，天氣狀況和水溫等環境因素也對抗生素及 ARGs造成影響（Cesare et al.，2017；Peak et al.，2007）。同時，抗生素的低水平及ARGs的高水平檢出說明：由歷史背景誘導產生的ARGs可進行自我擴增而持續存在于環境中（Ling et al.，2013）。

4 結論

（1）東寨港海水和沉積物的ARGs豐度處于較高水平，這將給當地微生物群落穩定性帶來考驗。

（2）沉積物中抗性基因污染比海水嚴重，說明沉積物是東寨港區域重要的ARGs儲存介質。

（3）東寨港抗生素檢出率較低，殘留較少，與ARGs相關性較弱。