金納米顆粒修飾酶生物電極檢測(cè)亞硝酸鹽

李佳汶, 馬偉師, 陳 佳, 李瑞楨, 袁基剛, 劉興勇, 梅昌艮

(1.四川輕化工大學(xué)a.化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院；b.化學(xué)工程學(xué)院， 四川 自貢 643000；2. 國(guó)家城市污水處理及資源化工程技術(shù)研究中心川南分中心， 四川 自貢 643000)

引 言

金納米顆粒(Au NPs)是一種具有很多優(yōu)點(diǎn)的納米材料，比如：能夠快速、簡(jiǎn)單地化學(xué)合成；形狀可控；粒徑分布窄；生物相容性好和易結(jié)合等[14-16]，已在生物電極中被廣泛應(yīng)用。已有研究表明，Au NPs作為修飾材料不僅能提高電極的響應(yīng)速度，而且由于其較高的穩(wěn)定性和生物兼容性，還能夠較好地保持其上固定的生物活性酶的生物活性[17-18]。

另外，酶等生物識(shí)別元件是生物電極具有特異性檢測(cè)性能的關(guān)鍵，除識(shí)別元件的成功固定外，識(shí)別元件的固有結(jié)構(gòu)及生物活性的保持也是酶生物電極制備的關(guān)鍵。聚多巴胺(PDA)由于可以很容易地黏附在幾乎所有類型的無(wú)機(jī)及有機(jī)基質(zhì)表面，還具有可控的薄膜厚度和持久的穩(wěn)定性等特性，因此是一種理想的固定劑。近年來(lái)，由于其優(yōu)異的生物相容性，PDA經(jīng)常被用作固定酶的合適基質(zhì)[19-22]。相比于其他不活潑或絕緣的聚合物粘結(jié)劑，PDA含有的鄰苯二酚基團(tuán)具有氧化還原活性，理論上是一種理想的能夠保持電極電化學(xué)活性的粘結(jié)劑材料[23-24]。

本文制備了一種新型的金納米顆粒修飾的酶生物電極，用于電化學(xué)定量分析檢測(cè)亞硝酸鹽。由于碳紙(CP)具有高比表面積和良好的電導(dǎo)率等優(yōu)異的特性，選擇使用CP作為電極基底。為進(jìn)一步加速電子傳遞并加強(qiáng)酶與電極之間的導(dǎo)電接觸，使用Au NPs修飾 CP。利用PDA的媒介作用將CcR固定在Au NPs修飾的CP上。采用物理化學(xué)表征技術(shù)對(duì)制備的酶生物電極進(jìn)行了表征，結(jié)果表明酶生物電極已成功制備，通過建立亞硝酸鹽濃度與電極還原峰電流密度之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了亞硝酸鹽的定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

VEGA3SBU型掃描電子顯微鏡(捷克 TESCAN公司)；X Flash Detector 410-M型X射線能譜儀(德國(guó)Broker公司)；DHG-9076 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；CHI660E型電化學(xué)工作站、鉑絲對(duì)電極、CHI150 飽和甘汞電極(上海辰華儀器有限公司)；PB-10 型pH 計(jì)(德國(guó)賽多利斯有限公司)。

細(xì)胞色素C還原酶CcR(99.9%，美國(guó)SIGMA- ALORICH公司)；氯金酸HAuCl4·3H2O(>99.9%，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司)；多巴胺DA(>98%，BBI生命科學(xué)有限公司)；三(羥甲基)氨基甲烷Tris-HCl(≥99%，生工生物工程(上海)股份有限公司)；HCP010N型碳紙(21 cm×20 cm×0.1 mm，上海河森電氣有限公司)；其余試劑均為分析純，購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試驗(yàn)用水為提取自UPC-I-10T型優(yōu)普系列超純水機(jī)的超純水(電阻率18.25 MΩ，成都超純科技有限公司)。

1.2 Au NPs的制備

將所有玻璃儀器在王水中徹底清洗，使用超純水徹底沖洗后于烘箱中40 ℃烘干備用。將100 mL含0.117 g/L的HAuCl4的水溶液加熱至沸騰，迅速向沸騰溶液中加入1.173 mL配置好的1%的檸檬酸鈉并持續(xù)攪拌。當(dāng)溶液顏色由淡黃色變?yōu)榫萍t色時(shí)繼續(xù)計(jì)時(shí)沸騰10 min，隨后停止加熱，繼續(xù)攪拌15 min后將制備的Au NPs膠體避光密封保存在4 ℃下備用。

1.3 CcR/PDA/Au NPs/CP 酶生物電極的制備

將CP依次浸入丙酮、乙醇、超純水中超聲清洗30 min后在80 ℃下對(duì)其進(jìn)行烘干處理。為了控制CP電極的面積，CP電極在修飾前其表面均用美國(guó)3M公司4-1000型防水膠帶控制，工作面積為0.1256 cm2。

將50 μL制備的Au NPs膠體滴涂在CP工作面積表面并將其在37 ℃下干燥。將干燥后的Au NPs/CP電極浸入攪拌中的20 mM多巴胺溶液(溶劑為0.05 M Tris-HCl，pH8.5)中3 h，取出電極，用超純水沖洗電極表面以消除過量的多巴胺。將電極在4 °C下與20 μL CcR溶液(濃度為20 mg/mL，溶劑為PBS緩沖溶液，pH為7.0)共同孵育12 h制得CcR/PDA/Au NPs/CP酶生物電極。

1.4 亞硝酸鹽的檢測(cè)

電化學(xué)相關(guān)性能測(cè)試及亞硝酸鹽檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，CcR/PDA/Au NPs/CP電極作為工作電極。在電化學(xué)檢測(cè)之前將電極置于PBS緩沖液(pH=7.0)中多次進(jìn)行循環(huán)伏安掃描以獲得穩(wěn)定的電信號(hào)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 所制備電極的物理化學(xué)性質(zhì)表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)所制備電極的表面形貌進(jìn)行表征，如圖1所示。從圖1a和圖1b 中可以看出，CP表面由表面光滑、直徑約為10 μm的碳纖維交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有良好的孔隙度。

由圖1c可以看出，當(dāng)CP被Au NPs修飾后，CP上碳纖維表面不再光滑，出現(xiàn)許多納米顆粒。由放大圖(圖1d)可以看出，碳纖維上納米顆粒的分布比較均勻，無(wú)明顯聚集現(xiàn)象。

由圖1e和圖1f可以看出，當(dāng)通過PDA的媒介作用將CcR固定到Au NPs/CP上后，電極表面形成了一層光亮的、均勻的膜。

a-b: 碳紙電極(CP);c-d: 金納米顆粒修飾碳紙電極(Au NPs/CP);e-f: 細(xì)胞色素C還原酶-聚多巴胺-金納米顆粒-碳紙電極(CcR/PDA/Au NPs/CP)
圖1 不同放大倍數(shù)下所制備電極表面的SEM圖譜

采用X射線能譜儀(EDS)對(duì)所制備的Au NPs/CP電極的元素組成進(jìn)行表征，如圖2所示。從圖2a中可以看出所制備的Au NPs/CP電極只含有Au和C兩種元素，不含其他元素雜質(zhì)，結(jié)合SEM結(jié)果說(shuō)明Au納米顆粒已經(jīng)成功附著在CP電極上。

通過Au NPs/CP 電極的EDS元素面分布圖(圖2b和圖2c)對(duì)比中可以看出 AuNPs/CP 電極的C元素和Au元素的位置基本一致，說(shuō)明Au NPs沉積的位置是在CP電極的碳纖維上，同時(shí)從圖2c可以看出，所沉積的Au NPs分布均勻。

a: Au NPs/CP 電極表面EDS能譜圖;b-c:Au NPs/CP電極元素面分布
圖2 X射線能譜儀對(duì)Au NPs/CP電極的元素組成表征

2.2 所制備電極的電化學(xué)性能表征

交流阻抗譜(EIS)測(cè)試結(jié)果可以反映出電子在不同電極上面的轉(zhuǎn)移速率，進(jìn)而可以得到不同電極的阻抗差異。在電解質(zhì)溶液為含有10 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1)的0.10 mol/L KCl 溶液、頻率范圍為0.01 Hz～100 kHz、振幅為5 mV的條件下，通過EIS測(cè)試對(duì)所制備電極的電化學(xué)性能進(jìn)行表征，如圖3所示。

圖3 不同電極的電化學(xué)阻抗譜圖

由圖3可知，與其他電極相比，未經(jīng)任何修飾的裸CP 電極的EIS譜半圓區(qū)域直徑最大；在經(jīng)過Au NPs修飾后，Au NPs/CP 電極的EIS譜半圓區(qū)域直徑顯著減小，電荷轉(zhuǎn)移電阻值從2000 Ω降低到約220 Ω，說(shuō)明Au NPs良好的導(dǎo)電性促進(jìn)了電子傳遞；相比于Au NPs/CP電極，PDA/Au NPs/CP電極的EIS譜半圓區(qū)域直徑明顯增大，其原因在于PDA的弱導(dǎo)電性在一定程度上阻礙了電子的轉(zhuǎn)移，同時(shí)也說(shuō)明了PDA已經(jīng)成功負(fù)載于Au NPs/CP 上；當(dāng)固定了CcR后，CcR/PDA/Au NPs/CP電極相較于PDA/Au NPs/CP電極，其EIS譜半圓區(qū)域直徑繼續(xù)增大，原因是CcR作為導(dǎo)電性能差的酶阻礙了電子轉(zhuǎn)移，同時(shí)也說(shuō)明CcR已成功固定在電極上。

通過循環(huán)伏安(CV)測(cè)試可反映各電極的電催化性能，在掃描速度為10 mV/S的情況下，所制備電極在不同溶液中的CV圖如圖4所示。在圖4中，由曲線a可以看出，在PBS緩沖液中，裸CP無(wú)電化學(xué)響應(yīng)電流；當(dāng)Au NPs修飾CP以后，電化學(xué)響應(yīng)電流增強(qiáng)(曲線b)，表明Au NPs增強(qiáng)了電極的導(dǎo)電性及電化學(xué)響應(yīng)；由曲線c可知，PDA/Au NPs/CP在-0.004 V和-0.1 V位置出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，這是由于PDA的鄰苯二酚官能團(tuán)的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)[25]，進(jìn)一步說(shuō)明PDA成功附著在Au NPs/CP表面；由曲線d可知，CcR/PDA/Au NPs/CP在+0.05 V和-0.15 V位置出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，這是由于CcR中Fe(III)/ Fe(II)的氧化還原反應(yīng)[26]，這進(jìn)一步說(shuō)明CcR已通過PDA的媒介作用成功地固定在電極表面。

2.3 CcR/PDA/Au NPs/CP電極還原峰電流與濃度之間的關(guān)系

3 結(jié)束語(yǔ)

采用Au NPs修飾CP電極提高了電極的導(dǎo)電性及電化學(xué)響應(yīng)，同時(shí)其納米尺寸增加了電極的比表面積，為后續(xù)CcR酶生物元件的固定提供了良好的平臺(tái)。利用PDA良好的附著性及氧化還原活性，固定CcR，同時(shí)作為保持酶與電極之間的電化學(xué)傳遞的媒介。Au NPs和PDA良好的生物相容性保持了酶的催化活性，結(jié)果表明所制備的CcR/PDA/Au NPs/CP電極在亞硝酸鹽的檢測(cè)中取得了良好的電化學(xué)響應(yīng)。本研究為使用酶生物電極構(gòu)建亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器提供了可行的思路與實(shí)驗(yàn)支持。