長鏈非編碼 RNA Linc-ROR與惡性腫瘤發生、發展關系的研究進展

劉帥臣 李玉明

在人類基因組中僅有2%的基因具有編碼蛋白的功能，其中絕大多數是由非編碼RNA組成。已有研究證實非編碼RNA在調節細胞功能和疾病發展過程中發揮關鍵作用，其中長鏈非編碼RNA(lncRNAs)在腫瘤發生、發展中的作用及角色成為當前研究的熱點問題。lncRNAs是指(轉錄本)長度超過200nt、無編碼蛋白功能的一類RNA分子[1]。盡管其不具有編碼蛋白的功能，但可通過基因印記、染色質修飾等多種方式在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后等多個層面調控生長發育相關靶基因的表達[2]。Linc-ROR是lncRNAs家族中的重要成員，近年來研究發現其在多種腫瘤組織中表達失調，與腫瘤的生長增殖、侵襲轉移、放射治療、化學治療耐藥性等病理生理過程密切相關。本文就近年來有關Linc-ROR在人類惡性腫瘤中的研究進展做一系統綜述。

一、Linc-ROR的概述

Linc-ROR是一種基因位于染色體18q21.31、包含4個外顯子的、長度為2.6kb的長鏈非編碼RNA，亞細胞定位結果顯示胞質及胞核中均有表達。它最初是在誘導多能干細胞相關的研究中被發現，具有通過阻止P53信號通路的激活參與多能干細胞及上皮干細胞的自我更新和干性維持的作用[3]。后續研究也表明Linc-ROR除了參與多能干細胞自我更新和干性維持外，還可以通過影響Oct4、Sox2和Nanog等多能性轉錄因子的表達，促進多種腫瘤細胞對放、化療的耐藥[4～7]。腫瘤轉移是一個復雜的生物學現象，它是由一系列相互聯系、序貫的步驟組成的高度選擇的、非隨機的過程，其中腫瘤細胞發生上皮間質轉化(EMT)被認為是造成腫瘤轉移的關鍵因素之一。近期研究發現Linc-ROR還可作為分子海綿吸附特定的微小RNA(miRNAs)，調控下游相關靶基因的表達，誘導腫瘤細胞發生EMT轉化，促進了腫瘤的轉移與復發[8]。在包括消化系統腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤組織中差異表達，發揮著重要的調控作用。

二、 Linc-ROR與消化系統腫瘤

1.Linc-ROR與胃癌：腫瘤干細胞是一類擁有自我更新能力的細胞，在癌癥的轉移、復發以及耐藥性中扮演著重要角色，被稱為腫瘤的“種子”。Wang等[4]通過流式細胞儀從MKN-45細胞中分選出了CD133+的胃癌干細胞(GCSCs)，并首次證實在CD133+的GCSCs中Linc-ROR表達量明顯升高。通過功能性實驗分析發現Linc-ROR能顯著提高GCSCs的增殖與侵襲力，并能夠抑制細胞的凋亡。為了進一步探討Linc-ROR對于維持胃癌細胞干細胞特性的作用，運用qRT-PCR及免疫印跡技術證實Linc-ROR能夠通過上調細胞干性相關轉錄因子(OCT4、SOX2以及Nanog)的表達，有效的維持了胃癌干細胞特性。Zou等[9]采用實時災定量PCR技術檢測了137例胃癌組織及對應的癌旁正常組織，結果提示Linc-ROR的表達水平在腫瘤組織中是顯著升高的，其表達量與腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關。通過對數秩檢驗及Kaplan-Meier方法分析發現Linc-ROR的表達與胃癌患者的總生存期顯著相關，Linc-ROR的表達量越高，患者的總體生存期越短。多因素分析顯示Linc-ROR可作為胃癌患者的獨立預后因素。以上結果表明，Linc-ROR作為胃癌重要的調控因子，其對胃癌的預后評估和靶向治療有著積極的意義。

2.Linc-ROR與肝癌：由于肝癌細胞所具有的輻射抗性，使放射治療在肝癌的治療中無法發揮出理想的效果。Chen等[10]通過對建立的抗放射線肝癌細胞系分析發現，Linc- ROR在抗放射線細胞系中表達量是增高的，經功能獲得型及缺失型模型分析表明，過表達Linc-ROR可增強肝癌細胞的DNA修復以及放射抗性，其作用機制可能是Linc- ROR通過分子海綿的方式吸附miR-145，上調其下游靶基因RAD18的表達而實現的。有研究顯示經TGF-β誘導的肝癌細胞化療耐藥性是顯著增強的，然而其具體機制卻不清楚。Takahashi等[11]通過基因表達譜分析發現，經TGF-β誘導肝癌細胞分泌的細胞外囊泡內lncRNAs是異常表達的，Linc-ROR、Linc-VLDLR、HOTAIR、Tsix等lncRNAs表達水平是顯著升高的。通過進一步體外實驗得出結論，TGF-β有可能是通過間接調控細胞外囊泡中Linc-ROR的表達量進而影響肝癌細胞對化療藥物的耐受性。以上結果表明，抑制Linc-ROR的活性有可能成為增加肝癌對放、化療的敏感度、改善患者生存質量的重要途徑。

3.Linc-ROR與結直腸癌：Li等[12]采用實時PCR技術檢測了78例結直腸癌組織標本及7種結直腸癌細胞系，發現在結直腸癌組織和細胞系中Linc-ROR的表達均高于匹配的正常組織及細胞；通過干擾Linc-ROR的表達后，抑制了細胞的生長，使細胞周期停滯在G0/G1期，并增加了細胞的凋亡。P53作為一種重要的抑癌基因，調控著細胞的生長、分化、凋亡及DNA修復等多種生物學過程[13]。研究者發現過表達Linc-ROR可抑制P53及其靶基因(p21和FAS)的表達，進而促進結直腸癌細胞的生長增殖以及裸鼠體內腫瘤的生長。放射治療被認為是結直腸癌患者術前的標準治療，然而相當多的患者對放射療法具有抵抗性。Yang等[7]通過大樣本分析發現Linc-ROR在結腸直癌組織和細胞系中均過表達。細胞凋亡加快是放射治療引起的最重要的損傷之一。功能實驗發現，轉染Linc-ROR基因后，能夠明顯抑制細胞的增殖，增加其凋亡，提高了細胞對放療的敏感度。最終證實Linc-ROR可通過靶向P53/miR-145途徑促進結直腸癌細胞的增殖及對放療的耐受性，同時減慢細胞的凋亡。Zhou等[14]在大量結直腸癌組織樣本中檢測證實Linc-ROR與miR-145的表達量呈明顯的負相關，且其表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、血管侵犯、TNM分期密切相關。Kaplan-Meier分析顯示Linc-ROR高表達的患者普遍具有較差的的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)，單因素和多因素分析表明Linc-ROR可作為結直腸癌患者預后的獨立影響因素，其表達量越高，患者的生存率越低，預后越差。所有這些結果提示，Linc-ROR作為一種致癌基因，參與了結直腸癌細胞的增殖、凋亡及放療耐受性，可作為結直腸癌治療的潛在新靶點，同時也可作為預測結直腸癌預后的新指標。

4.Linc-ROR與食管癌：Shang等[15]通過生物信息學的方法發現Linc-ROR的表達水平與食管鱗狀細胞癌患者預后不良相關，同時采用實時熒光定量PCR對91例食管癌組織及其匹配的正常組織進行驗證得到了相同的結果。lncRNAs可作為分子海綿吸附特定的miRNAs，調節下游靶基因的蛋白水平，參與調控細胞的生物學行為。體外實驗證實過表達Linc-ROR可增強食管癌細胞的侵襲與遷移能力，為進一步研究其分子機制，通過熒光素酶報告基因及RNA免疫沉淀技術測定發現Linc-ROR與miR-145有兩個結合位點，過表達Linc-ROR可下調高達50%的miR-145，這進一步驗證了二者的相關性。FSCN1作為FSCN家族中的重要成員，具有促進細胞運動、擴散的重要作用，Linc-ROR可通過與miR-145競爭性結合，增加FSCN1的表達水平進而促進食管癌細胞的侵襲與轉移[16]。

5.Linc-ROR與膽囊癌：Wang等[17]報道，膽囊癌組織及細胞中均檢測到Linc-ROR過表達，且其表達水平與腫瘤直徑、淋巴結轉移呈正相關，Kaplan-Meier生存分析和對數秩檢驗顯示，Linc-ROR的高表達與膽囊癌患者的總體生存時間密切相關。通過過表達及敲除實驗發現Linc-ROR可促進膽囊癌細胞的增殖、侵襲及遷移，抑制細胞的凋亡。轉化生長因子β(TGF-β)作為腫瘤發生及轉移的關鍵調控者，TGF-β相關信號通路的改變可引起癌細胞發生EMT轉變從而增強腫瘤的增殖、侵襲與轉移。實驗證明抑制Linc-ROR的表達后可逆轉經TGF-β1誘導的細胞發生EMT轉化，故Linc-ROR可能作為治療膽囊癌的分子靶標及預后的潛在生物學標志物。

6.Linc-ROR與胰腺癌：吉西他濱耐藥是胰腺癌化療失敗的主要原因之一。Li等[5]發現在胰腺癌組織和細胞中Linc-ROR的表達均升高，體外實驗證實過表達或敲除Linc-ROR后能夠影響細胞的增殖、凋亡及對化療藥物吉西他濱的敏感度。生物信息學分析表明，Linc-ROR和miR-124之間包含相應的結合位點，通過熒光原位雜交和熒光素酶報告基因實驗證實了Linc-ROR與miR-124表達之間呈負相關，最終確定Linc-ROR是通過誘導自噬和調節miR-124/PTBP1/PKM2軸增加了胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性。Zhan等[18]通過功能學實驗證實Linc-ROR影響胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移。將轉染Linc-ROR的胰腺癌細胞通過尾靜脈注入小鼠體內可促進胰腺癌細胞遠處轉移(肝臟、肺臟)。通過基因芯片篩選出了顯著差異表達的ZEB1基因，大量文獻已證實ZEB1在多種腫瘤中異常表達，通過調節腫瘤細胞的EMT過程，促進腫瘤發生、發展。在探討LincRNA-ROR與胰腺癌發生機制關系時發現， LincRNA-ROR通過抑制P53的激活，上調ZEB1誘導腫瘤細胞發生EMT，促進了胰腺癌的侵襲和轉移。Gao等[19]通過對大量組織樣本進行統計分析證實Linc-ROR在胰腺癌中呈高表達，其表達水平與腫瘤直徑及患者預后密切相關。通過體外實驗證實敲除Linc-ROR后能夠抑制胰腺干細胞(PCSCs)的生長及遷移，促進細胞發生凋亡，同時可導致注入裸鼠體內PCSC的致瘤性顯著降低，對裸鼠腫瘤組織進行免疫組化分析發現，瘤內Nanog和Ki67的表達明顯下調。最終證實了Linc-ROR作為miR-145的ceRNAs，通過調節多能性轉錄因子Nanog的表達進而影響PCSCs的干性維持及生物學作用，促進胰腺癌的發生、發展。以上研究結果表明，Linc-ROR作為胰腺癌重要的調節因子，通過多過程、多因素共同調控胰腺癌的發展。

三、 Linc-ROR與乳腺癌

作為治療癌癥最有效的化療藥物，5-氟尿嘧啶(5-FU)和紫杉醇已被廣泛應用于臨床。既往的研究表明5-FU和紫杉醇能夠逆轉腫瘤的EMT過程，抑制腫瘤的侵襲轉移。通過實時災光定量PCR技術檢測142例乳腺癌組織標本，Li等[20]研究發現Linc-ROR的表達量高于正常組織，其表達水平與淋巴結轉移密切相關。隨后，研究者通過過表達和敲除試驗發現Linc-ROR具有促進EMT的進展過程、拮抗5-FU和紫杉醇抑癌的作用，但Linc-ROR調控乳腺癌細胞侵襲與耐藥的具體作用機制仍需進一步深入探索。他莫昔芬作為乳腺癌患者內分泌治療的一線藥物，已廣泛應用于臨床。目前有證據表明因為生長因子信號的干擾以及雌激素受體的突變，導致近年來激素非依賴型乳腺癌的患者比例明顯上升，加劇了患者對內分泌治療的耐藥性。Peng等[21]通過對構建的雌激素非依賴型乳腺癌細胞模型分析發現，Linc-ROR的表達增加倍數變化是最大的。通過功能試驗發現其能促進乳腺癌細胞的增殖，并與他莫昔芬的藥物抵抗性有關。DUSP7作為ERK的負性調節因子，有研究證實DUSP7表達下調與乳腺癌患者的不良生存預后有關。進一步探討其機制發現Linc-ROR通過抑制DUSP7的表達，繼而激活MAPK/ERK信號，最終增強雌激素非依賴性乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性。Zhao等[22]在乳腺癌外周血液樣本中檢測到Linc-ROR呈高表達，且其表達水平與淋巴結轉移、雌激素受體、孕激素受體的表達呈正相關。另外，通過對乳腺癌患者手術前后血漿中Linc-ROR的表達量分析發現，術后血漿中Linc-ROR的表達量明顯下降。此外相比于乳腺癌常用的血清腫瘤標志物CEA和CA153，Linc-ROR有著更高的敏感度和特異性，且將3種標志物聯合檢測可提高乳腺癌的早期檢出率。上述研究結果證實，Linc-ROR極有可能在未來成為乳腺癌的特異性分子診斷標志物及治療的有效靶點。

四、 Linc-ROR與卵巢癌

在卵巢癌中Linc-ROR的表達明顯高于其匹配的正常卵巢與輸卵管組織，且高表達的Linc-ROR與TNM分期、淋巴結轉移呈正相關。在體內外實驗中過表達的Linc-ROR可促進卵巢癌細胞的生長、轉移和腫瘤在體內的生長。為了深入了解具體機制，通過Western blot法檢測發現，Linc-ROR表達量的變化可影響EMT標志物(E-cadherin、Vimentin)及Wnt/-catenin信號通路的關鍵基因(β-catenin及c-myc)的表達。這些結果提示Linc-ROR可通過調控Wnt/β-catenin信號通路誘導卵巢癌細胞發生EMT促進卵巢癌的侵襲與轉移。

五、 Linc-ROR與肺癌

Shi等[23]發現在順鉑耐藥肺癌細胞株中Linc-ROR的表達量高于普通肺癌細胞株，過表達Linc-ROR后可促進肺癌細胞的增殖、侵襲及小鼠移植瘤的重量與體積，同時逃避細胞的凋亡。深入探討其機制證實Linc-ROR通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路最終增強肺癌細胞對順鉑的耐藥性。有研究采用實時熒光定量PCR技術檢測了229例肺癌組織標本，發現Linc-ROR在腫瘤組織中明顯高于配對的正常組織，且腫瘤組織中Linc-ROR的表達量與TNM分期、遠處轉移及淋巴結轉移呈正相關。KaplanMeier生存分析和多因素分析進一步表明，Linc-ROR高表達與更短的OS和DFS顯著相關，Linc-ROR可作為肺癌患者OS和DFS的獨立預測因子。有研究經基因芯片篩選出了表達量明顯增高的Linc-ROR，將肺癌細胞中的Linc-ROR敲除后細胞的增殖與侵襲明顯延緩，對多西他賽的敏感度也顯著增強，體內實驗也得到了相同的結果。最終發現Linc-ROR可通過調控miR-145的活性，上調其靶基因FSCN1的表達水平，促進了肺癌的增殖、轉移及耐藥性。上述研究結果表明，Linc-ROR在肺癌的發展中起著致癌作用，有望成為肺癌新的治療靶點及預后指標。

六、 展 望

Linc-ROR作為一種近年來新發現的非編碼RNA，已被證實在多種惡性腫瘤中異常表達，通過作為miR-124、miR-138、miR-145等多種miRNAs的ceRNAs以及調控PI3K/AKT/mTOR、Wnt/-catenin、MAPK/ERK等多種信號通路的方式來影響癌癥的增殖、侵襲、凋亡以及放療、化療耐藥性等過程，并且在調節多能干細胞重編程方面發揮著獨特的作用。但目前對于Linc-ROR的研究大多數局限于初級階段，其在腫瘤中具體的生物學功能以及分子機制尚不十分明確，仍需進一步深入研究。相信隨著生物技術的廣泛應用、多相關學科的聯合發展，Linc-ROR有望成為腫瘤早期診斷、靶向治療及預測轉歸的重要指標，為癌癥的臨床診療提供新思路。