心臟發育過程中的分子調控

吳 錚 許棟明 孫芳玲 劉婷婷 郭德玉 艾厚喜 王 文

據WHO統計，2012年我國引起死亡的十大疾病中，缺血性心臟病位居第2位，并呈逐年上升的趨勢。而目前已知的是，心肌梗死的病理機制是由于嚴重冠狀動脈粥樣硬化堵塞冠狀動脈管腔，而導致心肌細胞長時間處于缺血、缺氧狀態下而引起細胞壞死，而缺血壞死的心肌細胞會引起心臟重構等結構變化，最終患者因不可逆的心肌梗死而引起心力衰竭導致死亡。但目前已知的治療心肌梗死的方法很有限，基本上是急性心肌梗死后引起患者出現癥狀后的介入治療，或口服藥物預防心肌梗死的發生；而傳統的藥物治療是針對左心室功能紊亂的機制來進行調節，并不能夠徹底解決心肌細胞壞死的根本問題[1]。

目前，人類心肌組織的再生仍然是作為治療心血管疾病主要的研究目標。人們曾一度認為成熟的心肌細胞不具備再生的能力，但是近些年研究發現一些魚類和兩棲動物可以在心肌受損后自行再生，新生鼠在出生后1周內也有這種再生修復能力[2，3]。也發現成年鼠在心肌梗死后也有少量的心肌細胞出現再生現象，雖然過程緩慢并不能夠完全彌補心肌梗死后大量心肌細胞的丟失。經cre-loxp方法追蹤發現，這些少量再生的心肌細胞可能來自于祖細胞池。為了能夠證實發生心肌梗死后的心臟可能會激發內源性心臟祖細胞分化成新的心肌細胞，關鍵是要更深入了解心肌細胞從胚胎分化和增殖的分子機制。本文主要將在心臟發育過程中一些相關分子的調控作用進行綜述，以及為研究心臟受損后的心肌細胞再生提供一定的理論基礎。

一、心臟的發育過程

小鼠心臟發育開始于胚胎發育第7.5天，這個時期(即原腸胚時期)胚胎有內胚層、中胚層和外胚層3個胚層，心臟組織大部分是從中胚層發育而來。由于胚胎的折疊作用導致生心區形成，第一生心區的心臟祖細胞增殖逐漸發育成線性心管。隨著心臟發育進行，心管的頭端逐漸與動脈極相連，尾端與靜脈極相連，到胚胎第9天整個心管開始發生彎曲。在彎曲的過程中，心管各段的細胞生長速度不同，導致心管膨大出心球、心室、心房和靜脈竇4部分，同時開始從靜脈極向動脈極泵血。緊接著房室在食管的壓制下，逐漸擴大形成原始的左心室和右心室。幾乎在胚胎第11.5天之后心肌細胞大量增殖，心臟內部開始分隔，逐漸形成4個腔室，心室壁在發育過程中出現心肌小梁，隨著心肌細胞增殖又逐漸消失直至出生[4]。

另外，脊椎動物心臟表面還覆蓋著與心肌細胞不同的一類組織：心外膜。心外膜不是一群簡單的同源細胞，在心臟發育過程的重要性常被忽視。人們一度認為心外膜是心包的一部分，起源于心肌細胞，直到19世紀60年代才對其有所發現并更正此觀念。小鼠胚胎第8.5天，前心外膜(proepicardium，PE)坐落在近靜脈竇的位置，接著遷移至心臟表面，附著后增殖，形成一層外膜結構包裹心臟[5]。心外膜雖與心肌細胞同時來自中胚層的分化，但是心外膜細胞本身具有分化能力，它可分化成平滑肌細胞、成纖維細胞或間充質干細胞，而心外膜細胞的分化能力可能會成為心肌梗死后心臟有能力再生的關鍵性線索[6]。

二、心臟發育過程中的分子調控

1.生心區形成的分子調控：心臟發育的第一步是原條細胞的T-box轉錄因子Eomesodermin(Eomes)激活BHLH轉錄因子——心臟特化起始標志物Mesoderm Posterior 1(Mesp1)，而這些原條細胞融合在中線靠近前腸的位置并形成生心區[7]。Mesp1可以通過細胞外基質中的因子FGFs、VEGFs和PDGFs激活Mesp1-RasGRP-ERK信號，以調節心臟前體細胞的遷移[8]。在心臟特化過程中Mesp1的調節是多面性的，既可促進心臟特化又可保持細胞多潛能性。心臟前體細胞轉移到生心區后，下調Mesp1和其家族的Mesp2激活轉錄因子來促使心臟進行分化。

心臟發育過程中還有一些信號通路決定了生心區的形成，包括來自前腸內胚層的促生心信號和來自中線以及神經板的抗生心信號，這些因子決定生心區大小以及形狀。促生心因子有Hedgehog、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、成纖維生長因子(fibroblast growth factors，FGFs)和非經典Wnt/JNK通路[9]；抗生心因子有經典Wnt信號通路、脊索分泌的BMP拮抗劑Noggin和Chordi[4]。

2.第一生心區和第二生心區的發育的分子調控：生心區包括第一生心區和第二生心區，最早表達Mesp1的前體細胞構成第一生心區(first heart field，FHF)——最初的生心區，而來自咽喉中胚層的Mesp1陽性前體細胞構成第二生心區(second heart field，SHF)[10]。相對FHF而言SHF的細胞增殖能力更強，但分化卻相對緩慢。FHF已經開始增殖分化并逐漸形成心管；而SHF仍處于未分化祖細胞的狀態。隨著心管的發育，靜脈極和動脈極逐漸形成，SHF的多功能祖細胞才遷移至靜脈極和動脈極參與心臟的發育。鼠的胚胎中FHF細胞主要分化構成左心室和心房的一部分， SHF細胞分化構成右心室、心房，流入道和流出道[11]。

FHF和SHF細胞表達的基因決定了其分化的早晚。FHF細胞表達Tbx5及HCN4和Nkx2.5[12, 13]。SHF細胞特異性的表達LIM同源轉錄因子Islet1和轉錄因子Tbx1，以及生長因子Fgf8和Fgf10。

經典Wnt /β-catenin激活鼠胚胎中SHF細胞的Islet1表達，同時保持Islet1陽性祖細胞分化潛能的穩態[14]。Islet1調節咽喉內胚層表達Shh，促進SHF細胞增殖。Shh也是SHF發育過程中很重要的分子，研究發現敲除Shh表達后會引起SHF細胞的缺失，最終導致右心室和流出道發育不全[15]。Shh促使Tbx1激活Fgf3、Fgf8和Fgf10，而Fgf8可以促進SHF發育，消融Fgf8心臟無法形成右心室或者流出道[16]。

3.心腔形成的分子調控：形成線性心管的心肌細胞被稱作初級心肌，它們有增殖速度慢、自律性有限、傳導性以及收縮性差的特性[17]。在心臟形成內部結構的初期，初級心肌未表現出增殖的形態，但是心管開始向外部擴張之后，初級心肌細胞就開始增殖分化并形成心房和心室的細胞。心管的蠕動可促使心臟形成的進程，同時心內膜和心肌細胞也根據血流動力的驅使以及心臟收縮方式改變著它們細胞的形態并且影響細胞增殖的速度，最終心房以及心室細胞構成腔室的結構，也具有了其細胞的特性，包括細胞的興奮性、自律性、傳導性和收縮性。

參與調節心腔形成的因子包括T-box的轉錄因子Tbx2、Tbx3、Tbx5、Tbx20以及Nkx2.5、Gata4、Cited1、Irx4、Irx1/Irx3/Irx5和Hand1[11]。各個轉錄因子在不同心肌細胞中表達不一。其中，T-box的表達模式比較狹窄，相比較Nkx2.5和Gata4表達在整個心管中，Tbx5只在流入道和初級心房中有較高的表達，在初級心室中表達相對較少，而在流出道中不表達；Tbx2和Tbx3相比較Tbx2表達量更大，它們在流出道、內部的結構、房室的管道和流入道的初級心肌中均有表達；而Tbx20在心管中廣泛表達[18，19]。Tbx5和Tbx20能夠結合Nkx2.5及Gata4通過誘導心房利鈉肽因子Nppa、連接蛋白connexin40和connexin43以及細胞骨架蛋白Chisel，促進心腔心肌細胞表達特異化[20]。Tbx5與Nkx2.5結合還可通過調節轉錄抑制因子Id2的表達，來調節左右心室肌束結構的形成[21]。與Tbx5和Tbx20不同，Tbx2和Tbx3也可以與 Nkx2.5和Gata4相互作用，達到抑制心腔增殖和特異性分化的作用，最終影響心腔的形成[11]。有研究發現，通過在小鼠體內對Tbx2過表達會可導致Tbx20表達的缺失，進而影響了心腔的發育[19]。轉錄因子Tbx3主要的功能是通過抑制竇房連接部位的細胞表達HCN4，而影響心臟竇房結的形成[21]。

心臟發育過程中形成的4個腔室，每個腔室的心肌表達基因并不完全相同。在小鼠的心房中通常表達MLC2a，而在心室中則表達MLC2v，其中左心室表達eHAND，右心室中表達dHAND[11]。在心房發育時，左心房高表達Pitx2，會抑制Shox2，導致竇房結發育受抑制進而阻止了異位起搏點的分化[22]。而在雞發育過程中，兩個腔室均表達Irx4，它是通過激活心室肌球蛋白MHC1而達到抑制心房表達MHC197，雞胚中右心室表達Tbx20，而左心室不表達Tbx20[23]。

4.心室心肌小梁發育的分子調控：在左右腔室形成后心肌細胞開始明顯增殖，結果分隔形成4個腔室，室壁擴增直至最后完成心臟的發育。在這個過程中心肌細胞從心外膜下層增殖形成一個收縮束樣的網狀組織，稱為網狀心肌小梁。心肌小梁細胞在結構上與內皮組織類似，心肌小梁多見于心室而少見于心房，并在冠狀血管發育前為心臟提供能量和氧氣。緊接著，心外膜下層心肌細胞增殖快于內層心肌細胞并呈現一種更小更致密的形態，這個過程稱為心室致密化，心室致密化一直持續到出生。在此期間，冠狀血管結構逐漸發育，心肌增殖能力逐漸減弱，在出生時致密的心肌幾乎包含整個左心室。

穿膜受體Notch1是心內膜與心肌相互調節最主要的受體，當心內膜細胞外的Notch結合Delta4和Jagged之后，其在心內膜細胞內的部分(notch intracellular domain，NICD)會斷裂開轉移至細胞核與轉錄抑制因子RBPJK結合，并上調BMP10達到激活細胞增殖的作用。在沉默rbpjk的小鼠心內膜中的EphrinB2和神經調節蛋白(neuregulin1，NRG1)表達量均下降，小梁發育時NICD1激活EphrinB2，而EphrinB2可促進NRG1表達，從而介導心肌細胞增殖[24]。NRG1是心內膜生長因子，與酪氨酸蛋白激酶受體ErbB4結合后和ErbB2形成二聚體，激活信號傳遞介導細胞生長和遷移[25]。沉默Tbx20的小鼠不能夠形成小梁，并會在胚胎發育10.5天死去，說明Tbx20主要的作用是促進心肌細胞分裂和小梁的形成而不是心臟祖細胞前期的分化[4]。

在心管形成后，心內膜和心肌層之間形成一層很厚的細胞外基質，稱為心膠質，心膠質對心肌小梁的增殖和心臟發育起到關鍵的作用。室間隔形成時心內膜和心肌的Has-1編碼生成透明質酸，Vcan編碼生成多功能蛋白聚糖versican，小鼠體內如果缺少這兩者則不能生成小梁，也會導致室間隔缺失[26]。整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶Ⅰ型結合蛋白(ADAMTS1)和共作用因子Fibulin-1能裂解versican影響心膠質的降解，心膠質降解的同時小梁增殖逐漸衰退；缺少Fibulin-1的小鼠ADAMTS1活性減弱，導致小梁過增殖同時心室致密化不能進行[27]。此外， Integrin β1與Integrinα可以形成異質二聚體，之后與成纖維細胞的纖連蛋白和膠原結合，促進心肌細胞增殖，其中成纖維細胞主要分布在致密部分； Integrin β1沉默的心肌細胞在致密化過程中的心肌細胞增殖速率明顯下降[28]。

三、心外膜發育的分子調控

小鼠的心外膜來自前心外膜細胞，PE最開始是菜花樣體腔細胞簇，它們向著心包腔指狀突出，隨著發育進行這些細胞聚集在心臟流入道后方，覆蓋橫隔。當PE接觸到心肌層，它們開始平鋪伸展成鵝卵石樣單層上皮，逐漸長滿整個心臟形成固定空間結構，即為初級心外膜。

Fgf8/Snai1可以調節前心外膜細胞最原始的發育，Fgfs能夠促進PE增殖同時保證PE不分化成心肌細胞。BMP2的低表達也能夠維持PE的特性通過促進Tbx18和Wilms腫瘤抑制蛋白(wilms tumor suppressor protein，Wt1)表達，然而高表達BMP2則誘導PE向心肌分化，抑制BMP信號能降低PE標志物Tbx18和Tcf21的表達。研究小鼠胚胎發現Integrinα4和血管黏附分子1(vascular adhesion molecule 1，VCAM-1)可穩定心外膜黏附于心肌層，并且使心外膜細胞在心臟表面遷移，靶向使VCAM-1或者Integrin 4失活會損壞心外膜和冠狀動脈的形成。

在PE形成初級心外膜后，一些心外膜上皮細胞向間充質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)后侵入到心肌層，為發育中的胚胎結構提供間質細胞。Wt1是這一過程中關鍵的調節因子，最早在小鼠胚胎9.5天的PE中表達，隨著發育的進行，Wt1開始表達于室間隔、左心室和右心室中，并且表達于心外膜的衍生細胞包括纖維細胞、平滑肌細胞以及內皮細胞中，但是否表達于心肌細胞和心內膜細胞中目前還存在爭議。Notch1信號通路在這一過程中促進血管祖細胞穿過致密的心肌細胞，這些細胞可以分化成心臟成纖維細胞、冠狀動脈血管平滑肌細胞。Wnt/β-catenin信號通路是EMT中重要調控因子，Wt1促進β-catenin和Lef1在心外膜中表達；相反，β-catenin缺失也會導致Wt1缺失，最終導致冠脈發育不全以及EMT不可進行。而維甲酸也調控著心臟發育及形態變化，并在Wt1缺失的心外膜細胞中Raldh2的表達降低，維甲酸合成也減少[6]。

目前也有一些研究發現心外膜細胞對于心肌梗死有一定的修復作用，如心外膜過表達Fstl1蛋白可以刺激細胞進入細胞周期，改善心肌梗死后心臟功能。在心肌梗死前注入胸腺素β4可以使部分成年鼠的祖細胞表達Wt1，使其具有成血管潛能；IGF1R可以調節心梗后Wt1細胞的EMT。然而目前人們對這些問題還有爭議，還需要進一步的研究探討。

四、展 望

心臟發育是胚胎發育中很重要的一個階段，其中的發育機制錯綜復雜，正逐步地被人們所探究發現。本文通過對心臟發育中大致的進程總結了相關分子的調控機制，希望可以對探索治療缺血性心臟病提供一定的啟示作用。因為缺血性心臟病嚴重危及患者生命，目前對于心肌細胞能否再生成為研究的重點。雖然目前體外細胞移植可以改善心臟功能，但收效有限，且沒有從根本上解決心肌受損這一問題，而且將其真正全面應用到心肌梗死的治療還需要進一步的改進。然而，還有一些問題目前還未得到證實，如心外膜細胞能否在心肌梗死發生后發揮其轉化作用，從而使其可轉化生成新的心肌細胞；還有心肌梗死后內源性祖細胞的變化能否通過信號通路中的分子過表達或沉默而生成新的心肌細胞，這些都可能會為缺血性心臟病的治療提供一些可能性。