高通量測序在多原發肺癌的診斷及解碼肺癌進化的價值

鮑 軼 莫娟芬

近年來隨著臨床影像學技術的進步及低劑量CT對肺癌高危人群篩查的應用，肺部多發結節、腫塊檢出的現象有增多趨勢。根據2013年《新英格蘭雜志》報道，通過低劑量CT對高危人群的篩查，使肺結節的發生率由8%增加至51%，而且肺癌病死率下降20%[1]。現有研究報道同時性多原發肺癌的發生率在0.2%～8.0%[2]。本文回顧高通量測序在多原發非小細胞肺癌診斷中的價值，并探討通過對多個原發癌灶全外顯子測序，對獲取非小細胞的進化機制，為更好的解碼肺癌生物學信息奠定基因，并為預防肺癌的發生及靶向精準治療，延遲患者的生存提供依據。

一、多原發肺癌的定義

多原發肺癌(MPLC)是指在同一個患者肺內出現兩個或兩個以上的原發性惡性腫塊，部位可以位于同側肺或兩肺，時間上可以是同時發現,被稱為同時性多原發肺癌(synchronous multiple primary lung cancer, sMPLC)，或者是異時檢測出且距首發肺部惡性腫塊診斷時間間隔超過2年,臨床稱為異時性多原發肺癌(meterochronous multiple primary lung cancer, mMPLC)[2]。MPLC需在術前與肺癌伴肺內轉移做出鑒別，因為根據目前TNM分期標準，同肺葉的伴同時性原發衛星結節，診斷為T4(臨床分期ⅢB期),而原發惡性腫塊在一側肺葉，而轉移病灶不同肺葉則認為是轉移性病灶(臨床分期為Ⅳ期),這與多原發肺癌，特別是sMPLC的處理方法是完全不同的[3]。不過實際診治過程中，往往是通過手術后病理標本的獲取，做出最終的診斷。

非小細胞肺癌是較為高發的肺癌病理類型，特別是近年來肺腺癌高發，多原發肺腺癌比例也呈現遞增趨勢。對于肺鱗癌，長期吸煙史是重要的發病機制，吸煙影響支氣管樹的不同敏感細胞后形成肺的浸潤性癌，可以同時或序貫發生，異時性原發性肺鱗癌的發生可能是多處肺組織因不斷暴露在吸煙等致癌性刺激下的結果[4]。目前肺腺癌的致病因素并不是很清楚，很多女性患者并沒有吸煙史，因此從分子水平研究多原發肺腺癌，不僅對于明確鑒別不同腫塊的性質，而且可以通過分子學水平對肺內多發性肺癌進行研究，找到肺腺癌可能的發病機制。

二、多原發肺癌的病理學診斷

多原發肺癌需與多原發肺癌與肺癌伴肺內轉移區分，在術前準確評估。根據Martini-Melamed的診斷標準，各個癌灶間彼此孤立，包括位于不同的肺段、或肺葉，各癌灶共同引流區域無腫瘤細胞累計，且無縱膈淋巴結及無遠處轉移。對于mMPLC，病理組織學類型相同時，無瘤間期至少2年，或均由不同的原位癌起源，或第2原發癌位于不同肺葉或不同側肺時，肺癌共同的淋巴引流部位無癌細胞累及，確立第2原發癌時無肺外轉移[5]。不過美國胸科醫師協會(ACCP)2013年對mMPLC的診斷標準指出對于第2原發癌組織類型相同時，時間間隔需不少于4年，若時間在2～4年則不能確定是mMPLC 還是肺癌的肺內轉移[6]。不過臨床實踐中仍然可能會存在同時或異時性原發性多難以肺癌伴肺內轉移進行鑒別，導致診斷延誤及治療方法錯誤。近年來分子生物學技術已經開始從基礎實驗室向臨床轉化應用，分子診斷學成為腫瘤診斷、預后判斷及篩選合適人群使用靶向藥物的必不可少的方法學。因此通過分析各癌灶的分子遺傳特征，幫助鑒別MPLC和肺癌伴肺內轉移，減少誤診的發生。

三、高通量測序在多原發肺癌中的應用

高通量測序(high-throughput sequencing)，又稱二代測序或下一代測序(next-generation sequencing technology，NGS)是近幾年來發展最為有價值的分子診斷技術之一，具有通量高、速度快、樣本量少、敏感度高等優點，目前已經被許多臨床實驗室開始用于遺傳性的胚系突變(germline)和獲得性的體細胞(somatic)基因突變的檢測[7]。細胞突變檢測可包括目標區域測序、全外顯子組(whole exome)、全基因組(whole genome)或線粒體DNA測序等，其中全外顯子測序是通過發現與蛋白質功能變異直接相關的遺傳突變，因此相對于全基因組測序費用會更低，數據更易于分析[8]。特別是針對特定疾病設定可行的目標區域的測序基因，分析檢測某些基因存在點突變(single nucleotide changes)、 插入或缺失不同數目的拷貝數(insertion or deletion of varying sizes copy number variations)、 重排(translocations)等，是疾病的診斷、用藥指導及預后判斷更為可行方法[9]。

2016年中國臨床腫瘤學會(CSCO)發布了《二代測序技術臨床應用共識》，通過國內臨床腫瘤學專家、生物信息學專家、病理學家等多個領域專家，對NGS的技術應用現狀、檢測內容、樣本處理、測序流程、數據管理、信息學分析、結果報告解釋等多個方面內容進行了詳細的闡述,這對臨床規范和有效應用高通量測序有著重要意義[10]。根據中國臨床腫瘤學會《二代測序技術臨床應用共識》，目前肺癌推薦需要檢測的基因包括表皮生長因子受體(EGFR)、kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(K-RAS)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS1)、間質上皮轉移因子(MET)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)。

前期筆者對多例臨床存在多個癌灶肺癌的患者進行術后病理組織分子診斷分析，通過采用Illumina公司設計并商品化的TruSight Tumor 15(美國Illumina Inc公司)，檢測甲醛固定的石蠟包埋(FFPE)腫瘤組織中15種常見基因突變，除了ALK，TruSight Tumor 15包括了中國臨床腫瘤學會要求的肺癌做的全部基因以及P53,通過分析各癌灶的分子遺傳特征，可以作為病理診斷的輔助手段，幫助區分與肺癌伴肺內轉移之間的差異，減少誤診的發生。而EGFR對亞洲人群來說可能是最重要的分子生物學標志物之一來鑒別多原發肺癌，而最近的一項來自中國的研究，通過分析多發磨玻璃樣肺癌結節中EGFR18-21號外顯子熱點突變，發現38個配對樣本中EGFR突變的差異率在92.1%[11]。而另一項研究入組了37例多發肺癌手術患者，根據Martini-Melamed診斷標準診斷多原發肺癌或肺癌伴肺內轉移，對配對樣本采用二代測序，通過選擇20個與肺癌密切相關的基因進行檢測，對臨床病理無法判斷肺癌伴肺內轉移，通過配對癌灶組織基因組突變分析，由于存在多個基因相同突變而診斷為肺癌伴肺內轉移，因此認為高通量測序可以作為傳統病理診斷有益的補充[12]。不過對于多原發肺癌可行的目標區域測序的基因組的選擇，找到較為全面并符合特定人群的基因組，用于幫助MPLC診斷，還需要后續更多大樣本的深入研究及共識討論[13]。

四、多原發肺癌生物學信息分析對解碼肺癌進化機制的研究

實際上多原發肺癌進化及各克隆灶的形成是一個長期復雜的過程，理論上多原發肺癌的克隆性形成一般是基于癌基因或抑癌基因發生體細胞突變，如P53點突變、X染色體失活分析或雜合性丟失(LOH)等。因此應該存在某一個或多個基因標志物，獨立且突變率發生較高，并且出現較早且貫穿于整個過程，而在肺癌進化過程中各克隆產生了不同的體細胞突變。由于抑癌基因P53的突變在肺癌中十分常見，且大多是點突變，在非小細胞肺癌中(NSCLC)高達50%，可能符合多原發肺癌標志物的要求[14,15]。另外，X染色體基因失活(X-inactivation)也可用于檢測克隆與腫瘤間的聯系，不過這種技術僅用于女性患者[16]。雜合性丟失(LOH)為一個多態位點從種系雜合性到純合性的轉變，喪失一個等位基因標志。LOH分析方法是依靠單核苷酸多態性和微衛星基因型的比較或腫瘤DNA樣本和病例匹配正常非瘤組織中獲取DNA樣本的比較[17]。2017年在《新英格蘭雜志》發表了一項大樣本的非小細胞肺癌(可切除的ⅠA至ⅡA期NSCLC患者)的研究報道，通過對327個區域進行了全外顯子組測序發現 EGFR、MET和BRAF突變大部分屬于早期突變和克隆性突變，而參與DNA損傷修復等維持基因組完整性的基因，如PIK3CA、NF1、TP53和Notch在75%以上的腫瘤發生突變，并且時間軸上發生較晚，另外CDK4、FOXA1和BCL11A的擴增，基因拷貝數的異常導致染色體不穩定性，這與腫瘤復發有著重要的相關性[18]。筆者前期通過1例確診為早期多原發肺腺癌的患者，去除胚系突變后發現不同的癌灶中均表達較高突變率的ERG同位點突變。ERG 屬于ETS家族融合基因，而 ETS-相關基因屬于E-26轉化(ETS)家族的轉錄因子, ERG融合基因激活是引起前列腺癌的發生和發展最為普遍的基因改變，而早期腫瘤中高頻率的ERG突變，可能提示多克隆灶在肺癌早期在相同的致癌環境，產生了某一個或多個基因的高頻點突變[19]。因此通過全外顯子測序，對肺癌克隆的進化機制的闡明，起著關鍵作用，而通過多原發肺癌各配對癌癥進行二代測序研究無疑對肺癌的發生的異質性、演變、治療及耐藥等均具有重要意義。鑒于目前無大樣本后續研究，這將是今后研究熱點之一。

綜上所述， MPLC 與肺癌伴肺內轉移在臨床治療及預后有顯著不同，需要在術前和術后做出準確判斷。對于高通量測序臨床使用，可以獲取不同腫塊的分子病理信息，作為“精準醫學”手段可用于輔助傳統的病理組織學診斷。通過深入研究，后續用于MPLC診斷的高通量測序基因組將會有統一的指導意見，并應用于臨床實踐。