柴白溫膽湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠內(nèi)皮功能及MMP-9/TIMP-1的影響

李志尚， 蔡海榮， 馮文偉， 趙帥， 張為章，高煥佳， 趙子聰， 陳燕虹， 陳伯鈞

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州，510405；3.東莞市中醫(yī)院，廣東東莞 523000）

《中國心血管病報(bào)告2017》指出我國目前約有2.9億心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）患者，心血管疾病死亡率居各病因之首[1]。心血管疾病不僅嚴(yán)重影響我國居民的健康和生活質(zhì)量，而且對(duì)家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種動(dòng)脈管壁增厚、變硬，失去彈性，管腔狹窄甚至堵塞的慢性非炎癥性疾病。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，影響著心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。隨著社會(huì)的進(jìn)步、生活方式的改變和人口老齡化進(jìn)程的加速，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率呈現(xiàn)上升和年輕化的趨勢(shì)[4]。因此，積極干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)防治心血管病具有重要的意義。中藥具有多靶點(diǎn)、多成分、整體調(diào)節(jié)、協(xié)調(diào)作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[5]。有研究報(bào)道，溫膽湯加減可以降低頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度、減少斑塊面積、抑制動(dòng)脈硬化進(jìn)程[6-8]。而柴白溫膽湯是陳伯鈞教授在溫膽湯基礎(chǔ)上化裁而成的經(jīng)驗(yàn)方，臨床治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化具有良好的療效。本研究復(fù)制了動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察柴白溫膽湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮功能和MMP-9/TIMP-1的影響，初步探討其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料SPF級(jí)健康雄性SD大鼠45只，4～5周齡，體質(zhì)量（100±10）g。普通飼料按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配方：蛋白質(zhì)22%，脂肪10%，碳水化合物68%；高脂飼料按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配方：基礎(chǔ)飼料65.3%，豬油15%，蔗糖10%，蛋黃5%，膽固醇4%，膽酸鈉0.5%，丙基硫氧嘧啶0.2%。大鼠和飼料均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0002。

1.2藥物柴白溫膽湯（半夏10 g，竹茹12 g，枳殼15 g，陳皮15 g，甘草6 g，茯苓20 g，柴胡12 g，白芍15 g，丹參15 g）中藥飲片均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供，由2名主任藥劑師鑒定為合格中藥飲片。煎煮方法：上述中藥飲片加6倍量的水浸泡30 min后煎煮40 min，濾渣取液；然后藥渣再加4倍量的水煎煮30 min，濾渣取液，2次藥液混合；然后100℃濃縮至2 g/mL，4℃保存。阿托伐他汀鈣片（美國輝瑞制藥有限公司），規(guī)格：20 mg/片，7片/盒，批號(hào)：20160262。

1.3試劑與儀器一氧化氮（nitric oxide，NO），內(nèi) 皮 素 1（endothelin 1， ET-1）， 血 栓 素 B2（thromboxane B2，TXB2），6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α），基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9），基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒均購自美國賽默飛公司。FC5718R 230V多功能冷凍離心機(jī)[奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司]；ICS685k-35LA/f電子臺(tái)秤[梅特勒—托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；日立-7180型全自動(dòng)生化分析儀（株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司）；Infinite M200TECAN酶標(biāo)儀（瑞士TECAN集團(tuán)公司）。

1.4造模、分組及給藥將45只大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，待其代謝狀態(tài)穩(wěn)定后，每只分籠喂養(yǎng)，隨機(jī)分為分為正常組（N=10）、造模組（N=35）。將35只大鼠參照劉煒楓等[9]方法復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型。具體方法：造模第1天，給予維生素D3以60萬U/kg的劑量一次性腹腔注射，然后每天給予高脂飼料（20 g/d）喂養(yǎng)，分2次喂服。正常組大鼠于造模第1天給予等體積的生理鹽水一次性腹腔注射，然后給予普通飼料（20 g/d）進(jìn)行喂養(yǎng)，分2次喂服。共喂養(yǎng)8周。造模期間所有大鼠均自由飲水。8周后從造模組隨機(jī)抽取5只模型大鼠，取腹主動(dòng)脈組織進(jìn)行光鏡和電鏡檢查以判斷造模是否成功，若有動(dòng)脈內(nèi)膜增厚或斑塊形成則提示造模成功。然后將剩余的30只大鼠隨機(jī)分為他汀組、模型組、柴白溫膽湯組，每組10只。按照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”，他汀組給予阿托伐他汀鈣片（0.6 mg·kg-1·d-1）灌胃，柴白溫膽湯組給予柴白溫膽湯（16 g·kg-1·d-1）灌胃，正常組和模型組每天給予等體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃。共給藥4周。給藥期間所有大鼠自由進(jìn)水和普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.5取材第12周末將所有大鼠處死，處死前禁食不禁飲12 h，經(jīng)腹腔注射100 g/L水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉，然后于腹主動(dòng)脈末端取血10 mL，6 000 r/min離心20 min后取上層血清，-70℃保存。

1.6ELISA檢測(cè)大鼠血清NO、ET-1、6-keto-PGF1α、TXB2、MMP-9、TIMP-1水平按照上述指標(biāo)ELISA試劑盒說明書步驟，先將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后，然后加待測(cè)樣品10 μL和樣品稀釋液40 μL，溫育30 min，加蒸餾水30倍稀釋，洗滌，加酶，再溫育、洗滌，顯色，加入終止液，測(cè)定。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1造模結(jié)果模型大鼠腹主動(dòng)脈組織光鏡結(jié)果顯示：血管外膜外可見脂肪組織，中膜平滑肌細(xì)胞明顯增加，管壁增厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞下聚集了大量泡沫細(xì)胞，形成一個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。見圖1-a。透射電鏡結(jié)果顯示：平滑肌細(xì)胞可見大量脂滴小泡，膜內(nèi)見吞飲小泡，胞漿中見膽固醇結(jié)晶樣物質(zhì)，細(xì)胞核中見異常染色質(zhì)。見圖1-b。光鏡、透射電鏡結(jié)果均表明動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型復(fù)制成功。

圖1 模型大鼠腹主動(dòng)脈病理學(xué)改變Figure 1 The pathological features of the aorta abdominalis in the model rats

2.2各組大鼠血清NO、ET-1水平比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清ET-1水平明顯升高（P＜0.05），NO水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴白溫膽湯組大鼠血清ET-1水平明顯降低（P＜0.05），NO水平明顯升高（P＜0.05）；柴白溫膽湯組大鼠血清NO、ET-1水平與他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清NO、ET-1水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of NO and ET-1 in various groups （±s）

表1 各組大鼠血清NO、ET-1水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of NO and ET-1 in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組他汀組柴白溫膽湯組ET-1[ρ/（pg·mL-1）]75.69±11.26 128.34±10.83①89.68± 8.65①②91.38± 13.25①②N 10 10 10 10 NO[c/μmol·L-1）]68.54±8.25 31.26±7.51①46.85± 8.13①②45.27± 6.24①②

2.3各組大鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2水平比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清6-keto-PGF1α水平明顯降低（P＜0.05），TXB2水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，柴白溫膽湯組大鼠血清6-keto-PGF1α水平明顯升高（P＜0.05），TXB2水平明顯降低（P＜0.05）；柴白溫膽湯組大鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2水平與他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2水平比較Table 2Comparisonoftheserumlevelsof6-keto-PGF1α and TXB2 in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各組大鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2水平比較Table 2Comparisonoftheserumlevelsof6-keto-PGF1α and TXB2 in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組他汀組柴白溫膽湯組6-keto-PGF1α 384.26±106.84 198.63±85.74①246.61± 72.38①②257.69± 95.73①②N 10 10 10 10 TXB2 126.87±46.92 268.76±84.46①184.34± 59.81①②196.28± 73.12①②

2.4各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-9水平明顯升高（P＜0.05），TIMP-1水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴白溫膽湯組大鼠血清MMP-9水平明顯降低（P＜0.05），TIMP-1水平明顯升高（P＜0.05）；柴白溫膽湯組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平與他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平比較Table 3 Comparison of the serum levels of MMP-9and TIMP-1 in various groups[±s，ρ/（μg·L-1）]

表3 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平比較Table 3 Comparison of the serum levels of MMP-9and TIMP-1 in various groups[±s，ρ/（μg·L-1）]

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組他汀組柴白溫膽湯組TIMP-1 268.41±72.34 113.72±42.18①179.32± 51.36①②187.26± 57.21①②N 10 10 10 10 MMP-9 26.85±4.46 67.28±10.53①39.62± 7.25①②41.59± 9.13①②

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病、腦梗死等心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，具有較高的發(fā)病率、致殘率和致死率。目前，關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化形成機(jī)制的經(jīng)典學(xué)說是脂質(zhì)代謝，但是血管內(nèi)皮功能障礙和細(xì)胞外基質(zhì)的降解等在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中亦起到了重要的作用。內(nèi)皮反應(yīng)學(xué)說認(rèn)為低密度脂蛋白、高血糖、高血壓、肥胖等多種危險(xiǎn)因素均可以導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，引起內(nèi)皮功能障礙，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[10]。內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)，內(nèi)皮功能障礙與動(dòng)脈硬化嚴(yán)重程度呈正比[11]。屈寶澤等[12]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病、腦梗死、高血壓等疾病患者均伴有不同程度的內(nèi)皮功能障礙。內(nèi)皮細(xì)胞不僅可以調(diào)節(jié)血管張力、抑制血栓形成，而且可以分泌前列腺素和NO等血管舒張因子及血栓素A2、ET-1等血管收縮因子，通過調(diào)節(jié)收縮因子和舒張因子的動(dòng)態(tài)平衡從而調(diào)節(jié)血管張力[13]。

NO和ET-1是一對(duì)重要的血管舒張和收縮調(diào)節(jié)因子，NO是最主要的內(nèi)皮舒張因子之一，NO能舒張血管平滑肌，進(jìn)而擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集、粘附，促進(jìn)血小板降解，防止血栓形成，抑制白細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞粘附，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，抑制低密度脂蛋白的合成，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[14]。ET-1是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血管收縮因子，與NO起拮抗作用，ET-1可以促進(jìn)內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞增殖，破壞內(nèi)皮的完整性和自我修復(fù)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[15]。NO與ET-1的動(dòng)態(tài)失衡即NO減少或ET-1增多，均可以引起內(nèi)皮功能障礙，損傷血管內(nèi)皮，引起動(dòng)脈粥樣硬化。

前列腺素和血栓素A2是一對(duì)重要的調(diào)節(jié)血小板活性和血管張力的活性物質(zhì)。前列腺素是重要的血管舒張因子，具有抑制血小板聚集、粘附，防止血小板聚集級(jí)聯(lián)反應(yīng)所需的酶，進(jìn)而抑制血小板的功能，從而防止血栓形成[16]。血栓素A2具有促進(jìn)血管收縮和血小板粘附、聚集的功能，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。因?yàn)榍傲邢偎睾脱ㄋ谹2極不穩(wěn)定，半衰期短，因而分別通過測(cè)定其代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α和TXB2來反映其體內(nèi)水平。高血脂、高血壓等危險(xiǎn)因素可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引起前列腺素生成減少，血栓素A2釋放增加，促進(jìn)血小板聚集，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤，刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[17]。

細(xì)胞外基質(zhì)是血管壁的重要組成部分，細(xì)胞外基質(zhì)降解失衡在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中同樣起到了重要的作用，MMP-9/TIMP-1是一對(duì)重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解和生成的活性物質(zhì)。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能特異性與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，MMP-9是MMPS家族分子量最大的酶，可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)，引起纖維帽溶解，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)和破裂，形成血栓，堵塞血管，引起心腦血管事件[18]。TIMP-1是一種糖基化蛋白，是MMPs重要的調(diào)節(jié)因子，可以通過與MMP-9結(jié)合，進(jìn)而抑制MMP-9與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，從而阻止基底膜的降解，穩(wěn)定斑塊，減少斑塊破裂[19]。而MMP-9/TIMP-1的動(dòng)態(tài)失衡，表現(xiàn)為MMP-9增多或TIMP-1減少，都可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，引起斑塊不穩(wěn)，甚至破裂。李子文等[20]研究發(fā)現(xiàn)MMP-9與心血管病患者動(dòng)脈斑塊嚴(yán)重性具有一定的相關(guān)性。

動(dòng)脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學(xué)“痰濁”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化為本虛標(biāo)實(shí)之病，氣滯是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，痰濁、瘀血是動(dòng)脈硬化的重要病理產(chǎn)物，也是疾病的中心環(huán)節(jié)。氣為血之帥，氣行則血行，氣滯則血瘀，氣虛則血瘀，血行不暢，聚而成瘀，瘀血阻滯心脈、血管，痹阻不通。脾主運(yùn)化水濕，肝木乘土，脾氣虧虛，脾虛運(yùn)化失常，水濕代謝異常，聚痰成飲，且?guī)X南地區(qū)地處亞熱帶潮濕地帶，外濕困脾，脾不運(yùn)化，聚痰成飲，痰濁阻滯心脈，痹阻不通。痰濁與瘀血互相膠結(jié)，痹阻血管，導(dǎo)致病程纏綿。柴白溫膽湯由溫膽湯化裁而來，方中半夏燥濕化痰，竹茹清熱化痰，陳皮理氣行滯、燥濕化痰，茯苓健脾利濕、杜絕生痰之源，柴胡疏肝解郁、理氣行滯，丹參活血化瘀，枳殼理氣寬中、行氣消脹，白芍、甘草養(yǎng)血柔肝，緩急止痛。綜合全方，共奏理氣行滯，活血化瘀，祛濕化痰之效。

本研究復(fù)制了動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，造模后給予相應(yīng)的藥物干預(yù)4周。干預(yù)后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的ET-1、TXB2、MMP-9水平明顯升高（P＜0.05），NO、6-keto-PGF1α、TIMP-1水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴白溫膽湯組大鼠的ET-1、TXB2、MMP-9水平明顯降低（P＜0.05），NO、6-keto-PGF1α、TIMP-1水平明顯升高（P＜0.05）。提示柴白溫膽湯可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化大鼠ET-1、TXB2、MMP-9生成，促進(jìn)NO、6-keto-PGF1α、TIMP-1的合成，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能和細(xì)胞外基質(zhì)降解平衡。

綜上所述，柴白溫膽湯可有效調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化大鼠內(nèi)皮功能和MMP-9/TIMP-1的平衡。