重組hCG對人子宮內(nèi)膜細(xì)胞AMHR2表達(dá)調(diào)控的研究

蘆小單,楊天時,劉 磊,方艷秋,林秀英

(1.吉林省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，吉林長春130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林長春130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗科，吉林長春130033)

子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity, ER)是指子宮內(nèi)膜接受胚胎的能力，胚胎的植入嚴(yán)格受到時間和空間的限制。子宮內(nèi)膜在激素的作用下，需調(diào)整到可允許胚胎黏附以及植入的狀態(tài)，這一時期被稱為“種植窗期”(window of implantation，WOI)，在排卵后第6～8天，或28天月經(jīng)周期中的第20～24天，種植窗期持續(xù)約48 h，是子宮內(nèi)膜做好準(zhǔn)備成功接納胚泡的階段[1]。ER在卵巢激素的作用下，與下丘腦激素、細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞所分泌的因子等共同形成子宮內(nèi)膜的微環(huán)境，在多種因素相互影響作用下建立了子宮內(nèi)膜容受性。人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG) 在眾多可對胚胎植入過程產(chǎn)生重要影響的因素中，是最為重要的物質(zhì)分子信號之一[2]。抗苗勒氏管激素(AMH)是由卵巢顆粒細(xì)胞分泌的二聚體糖蛋白，通過其二型受體AMHR2發(fā)揮作用，可通過其反映卵巢的儲備功能，但其與子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究主要探討hCG、AMH及其受體在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性功能中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和實驗材料

細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；7500 Fast型熒光定量PCR儀(ABI公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(天能公司)。

DEME/F12培養(yǎng)基(HyClone公司)；胰蛋白酶(HyClone公司)；胎牛血清(Corning公司)；人重組hCG(美國默克公司)；總RNA的TRIZOL試劑盒(全式金生物公司)；熒光定量PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司)；RIPA試劑(碧云天公司)；鼠抗人GAPDH單克隆抗體，兔抗人AMHR2多克隆抗體(Santa Cruz生物技術(shù)公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Santa Cruz公司)；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液(達(dá)科為公司)。

1.2 臨床資料

所有研究對象在進(jìn)入助孕治療周期后，行子宮內(nèi)膜淺表機(jī)械刺激并留取子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本。均采用一次性子宮內(nèi)膜取樣器，在消毒外陰以及陰道后使用一次性宮腔組織吸引管探入子宮底部負(fù)壓抽取少量子宮內(nèi)膜于無菌管中。排除標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)內(nèi)分泌異常；B超檢測子宮內(nèi)膜有異常回聲；染色體異常及傳染病活動期等。本研究已通過吉林省人民醫(yī)院倫理委員會審核，患者已簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將子宮內(nèi)膜組織剪碎后，用胰酶進(jìn)行消化，37℃消化30 min后，進(jìn)行離心和洗滌，分離得到原代人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞[3]。將子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%抗生素DEME/F12培養(yǎng)基,將其放入37℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)3天，隔天換液，觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)。待細(xì)胞生長良好，鋪滿10 mm平皿，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化下來以分離細(xì)胞，將其平鋪于6孔板中，編號1～6。實驗組(1～3孔)用人促絨毛膜性腺激素處理(100 ng·mL-1)細(xì)胞，對照組(4～6孔)加入同體積的PBS(磷酸鹽緩沖液)。處理24 h后收集細(xì)胞，重復(fù)3次做提取RNA及提取蛋白的實驗。

1.4 熒光定量PCR測定

用TRIZOL方法將試劑加入待處理的細(xì)胞中，提取總RNA，IMPLEN機(jī)器檢測RNA濃度，用Promega試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列，AMHR2上游引物：GATTTGAGGCCTGACAGCA；下游引物：GCCAGGTGGATGGGTGTAG；18S上游引物：CATTCGAACGTCTGCCCTAT，下游引物：GATGTGGTAGCCGTTTCTCA。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次；72℃ 10 min。計算基因表達(dá)水平的差異采用2-△△CT方法。

1.5 蛋白免疫印跡分析法檢測AMHR2的表達(dá)

用RIPA試劑提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，在室溫條件下脫脂牛奶封閉2 h，與鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1000)，兔抗人AMHR2單克隆抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜，漂洗后再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉2 h，最后采用ECL試劑盒顯影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間差異比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離得到人子宮內(nèi)膜細(xì)胞

采集子宮內(nèi)膜標(biāo)本，分離原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過細(xì)胞免疫化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)AMHR2在分離得到的原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞中有表達(dá)(圖1)。

圖1 原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞中表達(dá)AMHR2

2.2 重組hCG對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞AMHR2基因表達(dá)影響

用人促絨腺素hCG(100 ng·mL-1)處理原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞24 h，提取RNA，通過熒光定量PCR實驗。與對照組相比，處理后AMHR2基因表達(dá)水平增加2.5倍，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，P<0.01)。

2.3 重組hCG對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞AMHR2蛋白表達(dá)影響

用人促絨腺素hCG(100ng·mL-1)處理原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞24 h，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過免疫印記雜交實驗，檢測AMHR2表達(dá)水平。與空白對照組相比，AMHR2蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，見圖2。

圖2 hCG對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞AMHR2表達(dá)的影響

3 討論

提高不孕癥患者妊娠率是臨床生殖醫(yī)學(xué)亟待解決的問題，著床期子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性是影響妊娠率的一個重要原因[4]。正確評價子宮內(nèi)膜容受性，并對其進(jìn)行合適的臨床處理，是提高妊娠率的關(guān)鍵，治療方法有待于不斷總結(jié)和提高。我們研究AMHR2與子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)性，探討AMH及其受體參與調(diào)節(jié)子宮“種植窗”過程中發(fā)揮的作用，具有一定的臨床應(yīng)用價值。重組hCG在促進(jìn)排卵、胚胎發(fā)育、種植和胎盤形成過程中具有重要作用，還能夠維持早期妊娠黃體功能[5]。近年來，有研究在子宮內(nèi)膜組織中定位了hCG受體/LH受體，并對其功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)hCG可由植入宮腔的胚胎分泌，能夠影響子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和腺上皮的功能，通過旁分泌與自分泌的方式影響細(xì)胞因子的分泌及胚胎種植[6-7]。在建立子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床的過程中，hCG起著不可或缺的作用，能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管形成，啟動和調(diào)控絨毛的侵襲性，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜中免疫耐受環(huán)境[8]。目前，臨床上使用hCG肌注或?qū)m腔灌注的方法，改善子宮內(nèi)膜容受性、促進(jìn)胚胎種植，但是其機(jī)制還不十分清楚[9-11]。還有一些研究表明，在體外受精—胚胎移植時，在胚胎移植前進(jìn)行宮腔內(nèi)灌注hCG，可大大提高種植率和妊娠率，這進(jìn)一步印證了hCG可以一定程度地改善子宮內(nèi)膜容受性[12-13]。

本實驗中，我們分離得到人子宮內(nèi)膜細(xì)胞，并檢測到AMHR2表達(dá)于人子宮內(nèi)膜細(xì)胞。體外實驗表明，hCG能夠顯著提高間質(zhì)細(xì)胞AMHR2基因和蛋白的表達(dá)水平，由此可以推測hCG在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性能中具有重要作用。但是目前國內(nèi)外對于子宮內(nèi)膜中hCG/LH受體的研究較少，而且現(xiàn)今提高IVF-ET妊娠率的一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)即子宮內(nèi)膜容受性的改善，hCG對提高子宮內(nèi)膜容受性的效果是近年來的研究熱點，因此深入研究hCG對子宮內(nèi)膜容受性改善的分子機(jī)制具有重要意義。