網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘丹蔞片治療冠心病的作用機(jī)制研究

侯杰軍1，雷 鵬2，陳金鋒，周巖芬，劉超峰，范 虹，張小飛4，雷忠義

冠心病(atherosclerosis，AS)是致人類死亡的首要疾病，主要是由于動脈發(fā)生粥樣硬化后引起的冠狀動脈血管發(fā)生管腔狹窄或阻塞，進(jìn)而引發(fā)心肌缺血、缺氧甚至壞死的一種疾病，嚴(yán)重危害人類健康[1-3]。冠心病心絞痛屬中醫(yī)學(xué)胸痹、心痛范疇，目前治療藥物主要采用活血化瘀類藥物。國醫(yī)大師雷忠義教授以幾十年的臨床經(jīng)驗(yàn)及研究，根據(jù)歷代醫(yī)家論述發(fā)現(xiàn)：冠心病發(fā)病多為中老年人，而中老年人多存在臟氣虧虛、脾胃虛弱、易生痰濁等癥狀；因而認(rèn)為氣虛血運(yùn)不暢、瘀阻脈絡(luò)、痰瘀互結(jié)為其發(fā)病原因。雷忠義教授運(yùn)用活血化瘀法及痰瘀互結(jié)理論為依據(jù)組方得到丹蔞片，該方治療冠心病心絞痛效果顯著。雷教授開創(chuàng)性地將胸痹心痛經(jīng)典理論中的痰濁說與瘀血說相結(jié)合，提出了痰瘀互結(jié)理論。丹蔞片是由雷忠義教授于20世紀(jì)70年代開始研發(fā)，后由吉林康奈爾公司生產(chǎn)的中成藥，其方劑組成主要由瓜蔞皮、薤白、丹參、赤芍、葛根、澤瀉、黃芪、骨碎補(bǔ)、郁金、川芎等10味中藥組成，功效為寬胸通陽、化痰散結(jié)、活血化瘀等。臨床常用于痰瘀互結(jié)證之胸痹心痛病。方中瓜蔞及薤白為君藥，瓜蔞發(fā)揮化痰理氣功效，薤白發(fā)揮豁痰通陽功效，二者相互配伍起到化痰散結(jié)、宣痹通陽之功；丹參、赤芍、葛根和川芎發(fā)揮活血化瘀及通絡(luò)止痛功效；黃芪發(fā)揮益氣溫陽，使氣旺血行之功效；澤瀉健脾滲濕，補(bǔ)而不滯；郁金、骨碎補(bǔ)發(fā)揮從腎治心之意，全方以痰瘀同治而發(fā)揮燥濕化痰、活血化瘀功效。大量的臨床研究表明本方療效確切，治療冠心病效果較好[4-7]。然而，丹蔞片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制的研究較少，尤其是缺乏對其作用機(jī)制的研究，因此，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為出發(fā)點(diǎn)，對其治療冠心病的潛在靶點(diǎn)及其通路進(jìn)行挖掘。

中藥是多成分、多作用通路協(xié)同發(fā)揮作用的系統(tǒng)過程，但由于研究過程中存在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，過程復(fù)雜等問題，使得研究難度較大，作為目前研究最火熱的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則具有較好的研究發(fā)展方向，其將系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、計算機(jī)輔助藥物設(shè)計、生物信息學(xué)等學(xué)科相結(jié)合，對復(fù)雜中藥系統(tǒng)的作用過程及機(jī)制進(jìn)行研究，具有較好的發(fā)展前景[8-9]。其采用“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，是對中醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治、系統(tǒng)論的具體闡釋。因此，針對丹蔞片治療冠心病的作用機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對丹蔞片的作用物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制進(jìn)行挖掘，為丹蔞片治療冠心病作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 資料與方法

1.1 丹蔞片化學(xué)成分的查找 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcm-sp.php)對丹蔞片全方，即瓜蔞、薤白、葛根、川芎、丹參、赤芍、澤瀉、黃芪、骨碎補(bǔ)、郁金的10個組方所有化學(xué)成分進(jìn)行查找，共搜集了1 094個化合物，其中瓜蔞80個，薤白87個，葛根18個，川芎189個，丹參202個，赤芍119個，澤瀉46個，黃芪60個，骨碎補(bǔ)71個，郁金222個。

1.2 丹蔞片候選化合物的篩選 采用口服生物利用度(OB)、脂水分配系數(shù)(AlogP)、類藥性(DL)預(yù)測本研究中各中藥，瓜蔞、薤白、葛根、川芎、丹參、赤芍、澤瀉、黃芪、骨碎補(bǔ)、郁金的化合物AlogP、OB和DL篩選閾值分別為AlogP≤5，OB≥30%，DL≥0.18。通過篩選，挖掘發(fā)現(xiàn)10個組方中的1 094個化合物分子中只有109個相應(yīng)條件，將其作為候選化合物。

1.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 本研究通過TCMSP平臺對篩選出的109個化合物的靶點(diǎn)進(jìn)行整理，并將其總結(jié)為表格。采用Cytoscape3.2.1軟件(http：//www.cytoscape.org/)對成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行構(gòu)建，以探究丹蔞片治療冠心病的作用機(jī)制。

1.4 疾病靶點(diǎn)的確定 通過OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//omim.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)、KEGG數(shù)據(jù)庫(https：//www.kegg.jp/)等進(jìn)行系統(tǒng)挖掘，以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞檢索冠心病相關(guān)基因，分別從 DisGeNET， OMIM，KEGG中獲取信息，合并數(shù)據(jù)運(yùn)用 Excel剔除(相同 Entry ID)重合基因條目信息(信息中包括基因?qū)?yīng)的蛋白名和 Entry ID)，獲取到與冠心病相關(guān)的基因和靶蛋白信息。

1.5 丹蔞片成分靶點(diǎn)交集冠心病疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 對篩選出的丹蔞片活性成分，利于Excel建立對應(yīng)的靶蛋白獨(dú)立文件，文件中包括分子名(molecule name)、成分編號、蛋白名(protein names)、基因名(gene names)和Uniprot ID(Entry ID，單一基因的標(biāo)準(zhǔn)化-Uniprot 數(shù)據(jù)庫中的唯一編號)。將從OMIM，KEEG，DisGeNET數(shù)據(jù)庫中篩選并合并出的冠心病相關(guān)靶蛋白建成獨(dú)立文件Excel文件，文件中包括蛋白名、基因名和Uniprot ID(Entry ID)。對冠心病靶點(diǎn)與丹蔞片活性成分靶點(diǎn)運(yùn)用Excel篩選功能，以Entry ID為查詢條件，映射出丹蔞片中每一活性成分與冠心病相關(guān)靶蛋白重合(交集)Entry ID部分，獲得丹蔞片活性成分作用靶蛋白和冠心病作用靶蛋白交集的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并獲取蛋白名、基因名和Uniprot ID。整合篩選出交集關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，以大于平均自由度為篩選條件篩選出核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 丹蔞片冠心病核心靶點(diǎn)通路富集分析 運(yùn)用Cytoscape3.7.1中CluoGO插件GO Biological Process 及R語言中的ClusterProfiler包來分析丹蔞片活性成分抗冠心病核心靶點(diǎn)生物過程，對獲取的丹蔞片成分-靶點(diǎn)-冠心病進(jìn)行生物過程和調(diào)控通路富集分析。具體步驟在Cytoscape 3.2.1軟件APPS中選裝ClueGOv2.5.4插件，在ClueGO界面選擇“ClueGO：Function”分析模式，在“Load Marker Listis”下選擇“Homo Sapiens[9606]”項(xiàng)，在文本框中粘貼篩選出丹蔞片活性成分與冠心病合集的核心靶點(diǎn)Uniprot ID(Entry ID)，呈現(xiàn)模式選“Groups”，ClueGO設(shè)置中勾選“GO Biological Process，KEGG-KEEG-305 terms”，勾選“Use GO Term Fusion”，對P<0.01的通路和生物過程中標(biāo)識極顯著性，依上述條件對丹蔞片成分-靶點(diǎn)-冠心病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物過程和調(diào)控通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 丹蔞片中含有的148個活性化合物基本信息 本研究將AlogP≤5，OB≥30%，DL≥0.18作為化合物的篩選依據(jù)，共篩選出丹蔞片中148個活性化合物。 丹蔞片中含有的148個活性化合物基本信息詳見表1。

表1 丹蔞片中含有的138個活性化合物基本信息

(續(xù)表1)

Mol ID成分編號 分子名AlogPOB (%)DL藥材MOL007077DS-24Sclareol4.2743.670.21丹參MOL007079DS-25Tanshinaldehyde3.8352.470.45丹參MOL007081DS-26Danshenol B2.5957.950.56丹參MOL007082DS-27Danshenol A2.0156.970.52丹參MOL007085DS-28Salvilenone4.2630.380.38丹參MOL007088DS-29Cryptotanshinone3.4452.340.40丹參MOL007093DS-30dan-shexinkum d2.8338.880.55丹參MOL007094DS-31danshenspiroketallactone3.2450.430.31丹參MOL007098DS-32Deoxyneocryptotanshinone4.3249.400.29丹參MOL007100DS-33dihydrotanshinlactone2.7738.680.32丹參MOL007101DS-34dihydrotanshinoneⅠ2.8645.040.36丹參MOL007105DS-35epidanshenspiroketallactone2.3768.270.31丹參MOL007108DS-36isocryptotanshi-none3.5954.980.39丹參MOL007111DS-37Isotanshinone Ⅱ4.6649.920.40丹參MOL007118DS-38Microstegiol4.7539.610.28丹參MOL007119DS-39miltionone Ⅰ3.3349.680.32丹參MOL007120DS-40miltionone Ⅱ2.1471.030.44丹參MOL007121DS-41Miltipolone2.7436.560.37丹參MOL007122DS-42Miltirone4.7338.760.25丹參MOL007123DS-43miltirone Ⅱ0.7744.950.24丹參MOL007124DS-44neocryptotanshinone Ⅱ3.6139.460.23丹參MOL007125DS-45neocryptotanshinone3.0152.490.32丹參MOL007127DS-461-methyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[5,6-g]benzofuran-6,10,11-trione3.2134.720.37丹參MOL007130DS-47prolithospermic acid2.7764.370.31丹參MOL007132DS-48(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphe-nyl)acryloyl]oxy-propionic acid2.69109.38 0.35丹參MOL007140DS-49(Z)-3-[2-(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)vinyl-3,4-dihydroxy-phenyl]acrylic acid2.8288.540.26丹參MOL007141DS-50salvianolic acid g2.2045.560.61丹參MOL007142DS-51salvianolic acid j3.7843.380.72丹參MOL007143DS-52salvilenone Ⅰ2.8832.430.23丹參MOL007145DS-53salviolone4.0531.720.24丹參MOL007149DS-54NSC 1224214.9934.490.28丹參MOL007150DS-55(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naph-tho[8,7-g]benzofuran-10,11-quinone2.4275.390.46丹參MOL007151DS-56Tanshindiol B2.3442.670.45丹參MOL007152DS-57Przewaquinone E2.3442.850.45丹參MOL007154DS-58tanshinone iia4.6649.890.40丹參MOL007155DS-59(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione3.5765.260.45丹參MOL007156DS-60tanshinone Ⅵ2.4445.640.30丹參MOL001002CS-01ellagic acid1.4843.060.43赤芍MOL001918CS-02paeoniflorgenone0.7987.590.37赤芍MOL001921CS-08Lactiflorin-0.57 49.120.80赤芍MOL001924CS-03paeoniflorin-1.28 53.870.79赤芍MOL001925CS-09paeoniflorin_qt0.4668.180.40赤芍MOL002714CS-04Baicalein2.3333.520.21赤芍MOL002776CS-05Baicalin0.6440.120.75赤芍MOL000492CS-06(+)-catechin1.9254.830.24赤芍MOL006990CS-10(1S,2S,4R)-trans-2-hydroxy-1,8-cineole-B-D-glucopyrano-side-0.57 30.250.27赤芍MOL006992CS-07(2R,3R)-4-methoxyl-distylin1.8959.980.30赤芍MOL006994CS-111-o-beta-d-glucopyranosyl-8-o-benzoylpaeonisuffrone_qt0.4436.010.30赤芍MOL006996CS-121-o-beta-d-glucopyranosylpaeonisuffrone_qt0.5165.080.35赤芍MOL007003CS-13benzoyl paeoniflorin0.7631.140.54赤芍MOL007004CS-14Albiflorin-1.33 30.250.77赤芍MOL007005CS-15Albiflorin_qt0.4248.700.33赤芍MOL007008CS-164-ethyl-paeoniflorin_qt1.0256.870.44赤芍

(續(xù)表1)

Mol ID成分編號 分子名AlogPOB (%)DL藥材MOL007012CS-174-o-methyl-paeoniflorin_qt0.8756.700.43赤芍 MOL007014CS-188-debenzoylpaeonidanin-3.28 31.740.45赤芍 MOL007016CS-19Paeoniflorigenone0.7965.330.37赤芍 MOL007018CS-209-ethyl-neo-paeoniaflorin A_qt1.4864.420.30赤芍 MOL007022CS-21evofolinB2.0764.740.22赤芍 MOL007025CS-22isobenzoylpaeoniflorin0.7631.140.54赤芍 MOL000830ZX-05Alisol B4.6434.470.82澤瀉 MOL000832ZX-06alisol,b,23-acetate3.8232.520.82澤瀉 MOL000849ZX-0116β-methoxyalisol B monoacetate4.3332.430.77澤瀉 MOL000853ZX-02alisol B3.7636.760.82澤瀉 MOL000854ZX-03alisol C3.5032.700.82澤瀉 MOL000856ZX-04alisol C monoacetate3.6733.060.83澤瀉 MOL000239HQ-01Jaranol2.0950.830.29黃芪 MOL000354HQ-02isorhamnetin1.7649.600.31黃芪 MOL000371HQ-033,9-di-O-methylnissolin2.8953.740.48黃芪 MOL000374HQ-155'-hydroxyiso-muronulatol-2',5'-di-O-glucoside-0.95 41.720.69黃芪 MOL000378HQ-047-O-methylisomucronulatol3.3874.690.30黃芪 MOL000379HQ-059,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside0.7436.740.92黃芪 MOL000380HQ-06(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofura-no[3,2-c]chromen-3-ol2.6464.260.42黃芪 MOL000387HQ-07Bifendate2.5631.100.67黃芪 MOL000392HQ-08formononetin2.5869.670.21黃芪 MOL000398HQ-16isoflavanone2.42109.99 0.30黃芪 MOL000417HQ-9Calycosin2.3247.750.24黃芪 MOL000422HQ-10kaempferol1.7741.880.24黃芪 MOL000433HQ-11FA0.0168.960.71黃芪 MOL000438HQ-17(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol3.1367.670.26黃芪 MOL000439HQ-12isomucronulatol-7,2'-di-O-glucosiole-0.68 49.280.62黃芪 MOL000442HQ-131,7-Dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene3.1139.050.48黃芪 MOL000098HQ-14Quercetin1.5046.430.28黃芪 MOL001040GBS-01(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one2.3042.360.21骨碎補(bǔ)MOL001978GBS-02Aureusidin2.0753.420.24骨碎補(bǔ)MOL002914GBS-03Eriodyctiol (flavanone)2.0341.350.24骨碎補(bǔ)MOL000422GBS-04kaempferol1.7741.880.24骨碎補(bǔ)MOL004328GBS-05naringenin2.3059.290.21骨碎補(bǔ)MOL000492GBS-06(+)-catechin1.9254.830.24骨碎補(bǔ)MOL005190GBS-07eriodictyol2.0371.790.24骨碎補(bǔ)MOL000569GBS-08Digallate1.5361.850.26骨碎補(bǔ)MOL000006GBS-09Luteolin2.0736.160.25骨碎補(bǔ)MOL009078GBS-10davallioside A_qt1.3362.650.51骨碎補(bǔ)MOL009087GBS-12marioside_qt1.9170.790.19骨碎補(bǔ)MOL009091GBS-11xanthogalenol4.7441.080.32骨碎補(bǔ)MOL004241YJ-02curcolactone1.4551.510.20郁金 MOL004244YJ-03(4aR,5R,8R,8aR)-5,8-dihydroxy-3,5,8a-trimethyl-6,7,8,9-tetrahydro-4aH-benzo[f]benzofuran-4-one1.2759.520.20郁金 MOL004253YJ-04Curcumenolactone C1.3539.700.19郁金 MOL004260YJ-05(E)-1,7-Diphenyl-3-hydroxy-1-hepten-5-one3.5764.660.18郁金 MOL004263YJ-06(E)-5-Hydroxy-7-(4-hydroxyphenyl)-1-phenyl-1-heptene4.5946.900.19郁金 MOL004291YJ-07Oxycurcumenol1.8067.060.18郁金 MOL004305YJ-08Zedoalactone A1.26111.43 0.19郁金 MOL004306YJ-09Zedoalactone B0.26103.59 0.22郁金 MOL004309YJ-10zedoalactone E1.2185.160.19郁金 MOL004311YJ-11Zedoarolide A0.0587.970.30郁金 MOL004313YJ-12Zedoarolide B1.06135.560.21郁金 MOL004328YJ-01naringenin2.3059.290.21郁金

2.2 冠心病相關(guān)靶點(diǎn) 從數(shù)據(jù)庫DisGeNET中獲取845條關(guān)于冠心病靶點(diǎn)信息、OMIM中獲取181條關(guān)于冠心病靶點(diǎn)信息。詳見表2。

表2 冠心病靶點(diǎn)信息

(續(xù)表2)

數(shù)據(jù)庫 靶點(diǎn)APLNR,MGP,HLA-DQB1,FCGR3B,PCSK1,MIF,FCGR3A,INSIG1,INS,F2R,IGF1,IGF2,BMPR2,MYH6,BCL2,CELSR2,EDNRA,NODAL,CXCL8,BHMT,ETS1,EPRS,COX1,TNC,COX2,IL15,C3,FOXO3,PPARD,ADRB2,ADRB1,ADRA2B,CYP3A4,ACAT2,GCLC,ADH1C,GJA5,CNR1,PLTP,ACTC1,LCAT,AC-TA2,GC,LEPR,CLU,CES1,PIK3CG,PGF,FN1,CYP11B2,CRELD1,HPSE2,CSF2,DEFA1,KIF9,MKL1,HEATR6,CRH,CYP1A2,CPS1,NOX5,SLC52A2,KI-DINS220,CYP3A5,CSF3,DNAH8,NQO1,ROBO3,CYP4A11,DEFA3,DSCAM,CYP2D6,CYP2C9,SENP2,RNF213,CYP7A1,NDST4,CYBB,HOMEZ,DTNA,GREM1,ZBTB21,IRX4,FOXP3,ASCC1,MLXIPL,FXN,FOS,FOLH1,WNT16,ISYNA1,FOXO1,EHD3,FUT3,SENP1,FOXP1,B3GAT1,PALD1,C5AR2,PD-CD4,GAPDH,GALNT3,GAD1,NXT1,MYLIP,GABPA,CES1P1,FEN1,EPHX1,SELENOS,MESP1,MARK2,ELANE,CFC1,SLC2A9,EGR1,PRDM10,EGFR,AS3MT,ETS2,EXTL3,PARL,HDL3,RIPK4,CCHCR1,FCGR2B,FCAR,BCOR,FBN2,F13A1,RNLS,F12,F8,NLN,ARSA,SUMO4,ARMS2,ANXA1,ANGPT2,AKT1,AHSG,ANXA2,APC,SEMA3D,ARN-TL,AQP5,TAS2R50,APOD,SERPINA9,HCAR2,NANOS3,APOC4,IRF2BP2,APOC2,PEAR1,ZGLP1,ADH1A,ACVR1,ACP1,ACHE,ADH1B,AGTR2,ADRB3,ADRA2A,OR13G1,ADORA3,ARSD,CPE,CHIT1,ARID5B,CHI3L1,CCL21,CDH13,CDK1,CD44,CNDP1,BUD13,CD40,CD34,CD86,ESYT3,ST6GALNAC5,ADIPOR2,CP,STN1,COMT,COL6A1,COL4A1,SP6,ADAM33,COL3A1,ACKR2,CCR7,MCFD2,TBL1Y,CAV1,IL23R,BCHE,AVP,SLC7A13,ATP5PF,ATP4B,ZNF627,DAND5,SERPINC1,ASGR1,DLEU7,SERPINA12,BCL2A1,OPN4,CASP1,SLC25A20,CACNA1C,CA2,KLF5,CMTM5,BMP4,EARS2,BGLAP,OSR1,KLF14,FGF21,NPPC,NNMT,NHS,TCN2,NFKBIA,TFAP2B,NR2F2,NFE2L2,NEUROD1,LEFTY2,TGFBR2,NDUFS2,NCAM1,TBX3,NOS1,TBX1,NOTCH1,SOD2,SOD3,SOX9,SPINK1,SPP1,SREBF1,SREBF2,ST14,STK11,TAC1,THBS4,THRA,TIMP1,WRN,MMP1,NR3C2,MEFV,LRP8,MEF2C,ST8SIA4,ADAM11,MAF,FGF23,KMT2D,WRB,MMP7,MMP8,MYBPC3,TNFAIP3,MYB,TNNT1,TRAF5,TRPC3,TNFSF4,SUMO1,MT1B,MMP14,MMP13,MIA,POU5F1,RAC1,MOK,PLGLB2,RBL2,PLAT,RENBP,RFC1,PITX2,RPA1,RPN1,RXRA,PTX3,PTPRC,PTPN1,POLD1,PRKAA1,PRKCE,MAPK3,MAPK8,PRKY,PNN,PROS1,PSMD9,TAS2R38,PTH,RYR2,RYR3,S100A9,SERPINB2,SFRP4,SRSF1,SRSF2,SH3BGR,PCSK6,P2RY1,SLC2A3,OPRM1,SLC19A1,NTRK3,NTRK2,PCDH8,PCNA,PCYT1A,S100A12,SCD,PF4V1,SERPINF1,SLC26A4,ENPP1,CCL18,CCL19,PDGFA,CCL22,CXCL5,CX3CL1,SMARCA2,DLC1,NPFFR2,HMGA1,SUB1,HLA-DRB5,TMED1,ADAMTS13,HNRNPUL1,PTPRT,CAPN10,HLA-DRB1,SLC2A6,HAS2,HSPA1A,CYS-LTR1,NES,YAP1,IRF8,EIF3M,ANP32B,MRPL28,LEFTY1,HSPA8,CXCR6,EBP,HAL,GUK1,GSTM2,ZFPM2,ANGPTL2,GDF1,DDAH2,DDAH1,SMUG1,BHMT2,GCK,GCH1,POC1A,GCG,TES,GCLM,GLP1R,GLUL,GRIK4,GPX1,SCAP,GPT,PALLD,GRK4,TAB2,GPER1,GPD1L,ABRAXAS2,GOT2,GNGT2,PLA2G2D,MKKS,KAT2B,NR1I2,ARHGEF7,LMAN1,SELENBP1,HAP1,LCN2,LDB2,TBX18,FCGR2C,IL1RL1,SLC33A1,PROM1,CREG1,TNFRSF11A,USP9Y,SMAD7,SMAD1,LTC4S,SRPX,SOAT2,MADD,LTBP1,IRS2,VAMP8,LRP6,TNFSF13,NREP,KLK1,KDR,IL15RA,IL18BP,IL7,IL5,IL4,IL2,MPZL2,IL1RAP,IGFBP3,AKR1A1,IGFBP1,IL16,IL17A,ELMO1,KCNA3,ITGAM,ITGA2,ISL1,QKI,ADAMTS1,LITAF,IRF6,CLOCK,INSR,HDAC9,PCLAF,IFNG

2.3 丹蔞片化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 通過對丹蔞片的作用挖掘，應(yīng)用Cytoscape軟件將10個藥物、148個化合物與成分的作用靶點(diǎn)為基礎(chǔ)構(gòu)建出“藥材-成分-靶點(diǎn)”相互網(wǎng)絡(luò)。在化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，共包括396個節(jié)點(diǎn)(10個藥物、108個化合物節(jié)點(diǎn)和278個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和2 020條邊。在數(shù)據(jù)處理過程中MOL004244等40多個成分，在該數(shù)據(jù)庫中還未有相關(guān)的靶點(diǎn)，故而在構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，只顯示相關(guān)的108個化合物。從圖1可知，化合物HQ-14、XB-08的靶點(diǎn)(152個)最多，其作用最為豐富。其次是GBS-04(62個)。表明這幾個成分對丹蔞片藥理功能的發(fā)揮作用較為重要。另外，在網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)PTGS2與最多的成分存在相互作用(91個)，其次為PTGS1。在433個挖掘出的靶點(diǎn)中，有386個靶點(diǎn)存在多個配體，而有47個靶點(diǎn)只有單一配體。這表明丹蔞片中的主要成分通過復(fù)雜的多靶點(diǎn)作用通路來發(fā)揮相應(yīng)的藥效，也從側(cè)面證明了中草藥發(fā)揮效用的整體性與復(fù)雜性。詳見圖1。

圖1 丹蔞片成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 丹蔞片活性成分-靶點(diǎn)-冠心病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 對丹蔞片的化合物潛在靶點(diǎn)與冠心病疾病靶點(diǎn)取交集，應(yīng)用Cytoscape3.7.1 軟件建立“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)由216個節(jié)點(diǎn)組成1 742邊，由10個中藥、103個成分節(jié)點(diǎn)和 103個蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，圓形紅色的表示藥物，菱形黃色的表示成分節(jié)點(diǎn)，三角形藍(lán)色的表示蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)。 103個蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)既是丹蔞片成分作用靶點(diǎn)，亦是冠心病發(fā)生的相關(guān)作用靶點(diǎn)，藥物-成分-冠心病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖2。該網(wǎng)絡(luò)中最大自由度值為366，平均自由度為8.713，取大于平均自由度到最大自由度作為“藥物-成分-冠心病靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)(見圖 3)，由91個節(jié)點(diǎn)組成，其中由9個藥物、64個成分節(jié)點(diǎn)和 18個蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，篩選的核心成分、核心靶點(diǎn)及其自由度見表3。

2.5 丹蔞片“藥物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”生物學(xué)功能富集分析 利用通過 ClueGO 對篩選出的18個核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行通路富集分析，主要生物過程見圖4、圖5。主要涉前10位的生物過程分別為調(diào)節(jié)血壓、管徑的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血管直徑、調(diào)節(jié)血管大小、管尺寸的調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、神經(jīng)遞質(zhì)生物合成過程、神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程、金屬離子傳輸?shù)恼{(diào)節(jié)、對流體剪切應(yīng)力的響應(yīng)等有關(guān)的通路。篩選出的通路提示，丹蔞片治療冠心病的作用可能是通過參與以上幾條生物學(xué)過程和通路發(fā)揮的，從而達(dá)到治療冠心病的目的。詳見表4。

2.6 KEGG通路分析 利用通過 KEGG挖掘分析得到123條通路，主要生物過程見圖6。其主要涉前10位的通路分別為調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、血小板活化、小細(xì)胞肺癌、Apelin信號通路、雌激素信號通路、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號傳導(dǎo)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路、cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路、精氨酸生物合成、PI3K-Akt信號通路等有關(guān)的通路。篩選出的通路提示，丹蔞片治療冠心病的作用可能是通過參與以上幾條生物學(xué)過程和通路發(fā)揮的，從而達(dá)到治療冠心病的目的。

圖2 丹蔞片“藥物-成分-冠心病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 丹蔞片“藥物-成分-冠心病靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)圖

表3 丹蔞片“核心成分/核心靶點(diǎn)及其自由度”網(wǎng)絡(luò)信息

圖4 丹蔞片“藥物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”ClueGO富集生物過程條形圖

圖5 丹蔞片“藥物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”ClueGO富集生物過程相互作用關(guān)系圖

表4 丹蔞片“藥物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”ClueGO富集通路及生物過程聚類分析

圖6 丹蔞片“藥物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”KEGG富集通路及生物過程

3 討 論

丹蔞片主要由瓜蔞皮、薤白、丹參、赤芍、葛根、澤瀉、黃芪、骨碎補(bǔ)、郁金、川芎等10味中藥組成，方中瓜蔞及薤白為君藥，瓜蔞發(fā)揮化痰，理氣功效，薤白發(fā)揮豁痰通陽功效，二者相互配伍起到化痰散結(jié)，宣痹通陽之功；丹參、赤芍、葛根和川芎發(fā)揮活血化瘀，通絡(luò)止痛功效，黃芪發(fā)揮益氣溫陽，使氣旺血行之功效；澤瀉健脾滲濕，補(bǔ)而不滯；郁金、骨碎補(bǔ)發(fā)揮從腎治心之意，全方以痰瘀同治而發(fā)揮燥濕化痰，活血化瘀功效。大量的臨床及研究表明本方療效確切，治療冠心病效果較好。

中醫(yī)治療以整體觀、辨證論治為指導(dǎo)原則，中藥是多成分、多作用通路協(xié)同發(fā)揮作用的系統(tǒng)過程。作為目前研究最火熱的系統(tǒng)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有較好的研究發(fā)展方向，其將系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、計算機(jī)輔助藥物設(shè)計、生物信息學(xué)等學(xué)科相結(jié)合，對復(fù)雜中藥系統(tǒng)的作用過程及機(jī)制進(jìn)行研究，具有較好的發(fā)展前景。其采用“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，是對中醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治、系統(tǒng)論的具體闡釋，這也為中藥復(fù)方的研究提供了一種新策略。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，初步挖掘、分析丹蔞片治療冠心病的可能作用機(jī)制，為丹蔞片治療冠心病作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

通過計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)挖掘技術(shù)，把維持整個生命體內(nèi)平衡的網(wǎng)絡(luò)作為整體，通過對丹蔞片中主要活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，并與冠心病病癥的相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行交集，篩選出丹蔞片活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的靶點(diǎn)所在的通絡(luò)進(jìn)行分析，結(jié)果提示丹蔞片中參與冠心病作用主要活性物質(zhì)是槲皮素、山奈酚、木樨草素、鞣花酸、柚皮素、丹參酮Ⅱa、芒柄花素、二氫丹參內(nèi)酯、7-0-甲基異丙醇胺、羥基芫花素、黃芩素、香葉木素、丹參新醌D、4-亞甲丹參新酮、楊梅酮、3，9-二- 0-甲基尼森香豌豆紫檀酚、異鼠李素、2-異丙基-8-甲基苯-3，4-二酮、脫氧基新隱丹參酮等成分，而以上成分交互作用的PTGS2、PTGS1、ESR2、F2R、ADRB2、RXRA、SCN5A、AR、ACHE、OPRM1、CA2、NOS2、PIK3CG、PPARG、NOS3、SLC6A4、NR3C1、AKT1等靶點(diǎn)是調(diào)節(jié)血壓、管徑的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血管直徑、調(diào)節(jié)血管大小、管尺寸的調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、神經(jīng)遞質(zhì)生物合成過程、神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程、金屬離子傳輸?shù)恼{(diào)節(jié)、對流體剪切應(yīng)力等冠心病發(fā)病治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

王富江等[10]發(fā)現(xiàn)丹蔞片對高血脂有治療作用，可能是通過調(diào)控PTGS2的轉(zhuǎn)錄水平來發(fā)揮作用的；丹蔞片中活性成分黃芩素[11]可以通過降低右心室收縮壓水平，改善心臟血流動力學(xué)參數(shù)，進(jìn)行心肺重構(gòu)，抑制 PASMCs的異常增殖，延緩血管重構(gòu)的作用，起到改善肺動脈血管的異常增厚，改善心肺功能。孫軍等[12]研究表明槲皮素可以通過調(diào)控PI3K/Akt通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化，從而使冠心病缺血部位得到新生和修復(fù)，這與本研究挖掘所得的Akt靶點(diǎn)通路相一致。劉玉梅等[13]研究結(jié)果顯示，丹萎片能降低高血脂大鼠血清中一氧化氮合酶(NOS)含量，保護(hù)血管內(nèi)皮，改善血流功能，且具有較好的預(yù)防動脈粥樣硬化的作用。