芎芷地龍湯不同時間預防給藥對偏頭痛動物模型CREB1a、CREB1b mRNA表達的影響

2岳廣欣巫鑫輝

偏頭痛是一種常見的、高度致殘的原發性頭痛，和較高的社會經濟負擔相關，并具有很高的患病率[1]，被世界衛生組織列為第六大致殘疾病[2]。研究顯示，每年有2.5%左右的頭痛病人會發展為慢性偏頭痛[3]，其中約38%的慢性偏頭痛病人需要采用預防性治療[4]。偏頭痛雖然不能治愈，但大量的研究證實規范的預防治療可以明顯地降低偏頭痛病人的發作頻率，減輕發作程度，減少功能損害，提高生存質量，減輕病人的經濟負擔[5-6]。但有研究顯示，目前偏頭痛的治療普遍不足，僅有約20%的人接受過預防性的治療[7]，其中超過25%的偏頭痛病人適合預防性治療，然而可能從中獲益的病人中有相當一部分沒有得到過預防性治療[3]。我國從古就重視預防治療，如《黃帝內經·素問》：“上工治其萌芽……下工救其已成， 救其已敗?！睆纳鐣F狀和病情需要來看，采用中藥治療偏頭痛有重要意義。本課題組前期研究了采用芎芷地龍湯1 d、3 d、7 d預防給藥對偏頭痛模型痛閾及血管活性物質的影響[8]，為深入探討芎芷地龍湯對偏頭痛的預防治療機制，本實驗擬觀察芎芷地龍湯不同時間點預防給藥后，三叉神經血管系統中三級神經元中CREB1a、CREB1b mRNA表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體動物(SPF級)成年雄性SD大鼠，體重(200±20)g，由維通利華實驗動物技術有限公司生產。動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥品與試劑 芎芷地龍湯(川芎、白芷、生石膏、地龍、元胡)由北京中醫藥大學東方醫院制劑室提取，每毫升含生藥2.0 g；硝酸甘油注射液(5 mg/mL)購于北京益民藥業有限公司；琥珀酸舒馬普坦片，每片25 mg，購于海南先聲藥業有限公司；異丙醇(無錫市化學試劑廠生產)；焦碳酸二乙酯(DEPC)，北京欣經科生物技術有限公司生產；三氯甲烷(氯仿)，由北京化工廠生產；TRIZOL Reagent(Invitrogen)；High Pure RNA Tissue Kit(Roche REF12033674001)；Go Taq 2-Step RT-qPCRsystem(Promega A6010)；Go TaqqPCR Master Mix(Promega A6002)。

1.3 實驗儀器 電動手持勻漿器(KONTES)；PCR儀(Bio-RAD CFX96 Real-Time System)；三用電子恒溫水箱(SHH.W21，北京中興偉業器儀有限公司)；分光光度計(Nano Vue plus)；恒溫震蕩金屬浴(Bioer，MB-102)；低溫高速離心機(SIGMA 3K15)。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組 SD大鼠隨機分為6組：生理鹽水對照組、偏頭痛模型組、舒馬普坦組、芎芷地龍湯1 d預防給藥組(1 d XZDLT組)、芎芷地龍湯3 d預防給藥組(3 d XZDLT組)、芎芷地龍湯7 d預防給藥組(7 d XZDLT組)。

1.4.2 造模及給藥 生理鹽水對照組：給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃7 d，普通飼養，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射生理鹽水2 mL/kg 。偏頭痛模型組：給予生理鹽水10 mL/(kg·d )灌胃7 d，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg(5 mg/mL)。芎芷地龍湯組：其他處理同偏頭痛模型組，給予芎芷地龍湯10.8 g/(kg·d)灌胃(1 d，3 d，7 d)，末次灌胃30 min后于頸背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg。舒馬普坦組：其他處理同偏頭痛模型組，給予琥珀酸舒馬普坦6 mg/(kg·d )灌胃7 d，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油。

1.4.3 取材 在造模完成2 h后，采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)進行深度麻醉，快速斷頭，在超凈臺內冰上剪開顱骨取腦，剝離出硬腦膜、丘腦、三叉神經脊束核、三叉神經節，然后放入2 mL的無菌外旋凍存管中，于液氮中迅速冷凍，-70 ℃低溫冰箱保存備用。

1.4.4 大鼠組織總RNA的提取和含量的測定

1.4.4.1 總RNA的提取 嚴格按照試劑盒(High Pure RNA Tissue Kit)的說明書進行操作，先將400 μL Trizol裂解細胞加入到裝有標本組織的離心管中，然后按順序加入適量的氯仿、異丙醇、75%的預冷乙醇、DEPC水，再分別進行純化、沉淀、洗滌、溶解總RNA操作。用微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。根據A260的值計算RNA濃度(單位：μg/μL)，然后根據A260/A280比值計算其純度，要求比值為1.8～2.0，比值低于1.6者剔除。

1.4.4.2 逆轉錄反應(reverse transcription，RT)步驟 嚴格按照試劑盒的說明書進行操作，對于20 μL反應體系，操作步驟如下：取1.5 mL離心管配制模板，加入：RNA 11 μL，引物(Random Primer) 1 μL，加入總RNA量1.1 μg；置于震蕩型恒溫金屬浴中，70 ℃、5 min，然后快速轉至冰上至少1 min；離心使液體收集于管底，加入：5×Reaction buffer 4 μL，氯化鎂25 mmol/L 2 μL，PCR，Nucleotide Mix 10 mmol/L 1μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，GoScrpt RT 0.5 μL；RNA引物混合液12 μL與逆轉錄混合液8 μL充分混合，置于震蕩型恒溫金屬浴中，震蕩加熱25 ℃、5 min，后放入三用恒溫電子水箱，42 ℃、1 h，再置于震蕩型恒溫金屬浴中，70 ℃、15 min，冷卻；立即PCR反應，后放入-20 ℃冰箱保存。

1.4.4.3 PCR引物設計 根據Genebank的序列和文獻參考，設計CREB1a、CREB1b、GAPDH的引物序列。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下，CREB1a-上游：5′GAGGTGTAGTTTGACGCGGT 3′,CREB1a-下游：5′TGAGCTGCTGGCATGGATAC 3′，擴增長度：243bp；CREB1b-上游：5′GCAGTGACTGAGGAGCTTGT 3′，CREB1b-下游：5′TGAGCTGCTGGCATGGATAC 3′，擴增長度：169bp；GAPDH-上游：5′GTTACCAGGGCTGCCTTCTC 3′，GAPDH-下游：5′GATGGTGATGGGTTTCCCGT 3′，擴增長度：177 bp。

1.4.4.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time RT polymerase chain reaction，real-time PCR) 取出等量的RT反應產物，分別擴增CREB1a、CREB1b、GAPDH基因。5倍稀釋RT反應產物cDNA：Nuclease-Free Water 40 μL，cDNA原液10 μL；real-time PCR體系：20 μL反應體系；cDNA稀釋液：4 μL；primer F(20 pmol/μL)：0.5 μL；primer R(20 pmol/μL)：0.5 μL；Mix，10 μL，加Nuclease-Free Water至20 μL；輕輕混勻，2 000 r/min離心20 s后進行PCR擴增；在95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，15℃、30 s下擴增共40個循環。反應結束后，得到每個樣品中相應目的基因的Ct值，然后減去GAPDH的Ct值，得出相對Ct值作為n值，再作1/2-n運算，得出每個樣品中目的基因的相對表達量即 Quantity(目的基因/GAPDH)，校正后得到每個樣品中目的基因CREB1a、CERB1b的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠三叉神經節、三叉神經脊束核、丘腦、硬腦膜的CREB1a mRNA表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠CREB1a mRNA在三叉神經節、三叉神經脊束核表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，在丘腦、硬腦膜表達水平降低，差異無統計學意義(P>0.05)。給藥干預后，三叉神經節、三叉神經脊束核CREB1a mRNA表達水平均降低，其中以7 d XZDLT組和舒馬普坦組降低明顯(P<0.01)；給藥干預后，丘腦、硬腦膜CREB1a mRNA表達水平有所變化，但其他各組與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

組別只數 三叉神經節三叉神經脊束核 丘腦 硬腦膜對照組61.121±0.0861.126±0.0541.051±0.0440.993±0.066模型組62.471±0.0591)2.148±0.0871)0.986±0.0740.926±0.0421 d XZDLT組61.863±0.1291)2)1.900±0.0701)2)1.118±0.0430.986±0.0583 d XZDLT組61.723±0.1171)2)1.328±0.0961)2)1.090±0.0650.841±0.0487 d XZDLT組61.373±0.0801)3)1.161±0.0413)1.056±0.0220.855±0.048舒馬普坦組61.176±0.0803)1.003±0.0561)1.133±0.0400.861±0.048

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 各組大鼠三叉神經節、三叉神經脊束核、丘腦、硬腦膜的CREB1b mRNA的表達 與對照組比較，模型組大鼠CREB1b mRNA在三叉神經節、三叉神經脊束核表達水平升高(P<0.05)；在丘腦、硬腦膜表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。給藥干預后，CREB1b mRNA在三叉神經節、三叉神經脊束核表達水平升高，以7 d XZDLT組和舒馬普坦組升高明顯(P<0.01)；在丘腦、硬腦膜表達水平，各組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

組別只數 三叉神經節三叉神經脊束核 丘腦 硬腦膜對照組6 1.208±0.0771.332±0.0332)1.015±0.0461.078±0.046模型組6 0.982±0.0451)0.993±0.0571)1.047±0.0481.013±0.0481 d XZDLT組6 1.258±0.0431.428±0.0311)2)1.105±0.0371.138±0.0373 d XZDLT組6 1.447±0.0791)1.525±0.0481)2)1.097±0.0651.082±0.0657 d XZDLT組6 1.525±0.1111)3)1.638±0.0431)3)1.155±0.0661.187±0.066舒馬普坦組6 1.583±0.1431)3)1.753±0.0261)3)1.123±0.0641.185±0.065

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；3)P<0.01

3 討 論

偏頭痛的發病機制目前沒有定論，以三叉神經血管學說為主流學說。三叉神經節發出假單極三叉神經初級纖維，其突觸終止于顱內外結構(血管)以及脊髓三叉頸復合體。三叉頸復合體的二級神經元通過脊髓丘腦束上行，終止于丘腦皮層的三級神經元[9]。在大腦中，cAMP反應原件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)在不同的區域表達，并調節多種功能，如細胞生長、增殖和記憶，以響應各種細胞內信號事件，包括突觸功效和突觸可塑性的長期變化[10]。有研究表明，CREB在三叉神經尾核中有大量表達，和其磷酸化產物pCREB是脊髓痛覺區域激活后表達的核蛋白。曲普坦減弱CREB在三叉神經系統中樞的活性，這導致對中樞敏化的潛在抑制[11]。和c-fos相似，CREB也參與了痛覺信號的處理，在脊髓水平，CREB在組織損傷誘發的炎癥和痛覺過敏之后脊髓神經元產生的長時程易化中發揮作用[12]。在核轉位之前抑制 CREB 可以阻止腦干內痛覺敏化的發生[13]。CREB在突觸可塑性和疼痛的調節中具有重要作用，通常被用作軀體感覺神經通路疼痛相關可塑性變化的標志物，其在前腦內介導的轉錄過程的增強能提高對慢性炎癥疼痛和神經性疼痛大鼠模型非毒性刺激的行為應答[14]。注射過CREB反義寡聚核苷酸的大鼠表現出程度更低的溫度痛覺過敏，提示脊髓CREB蛋白水平的降低可以減少痛覺過敏的應答[15]。感覺神經細胞體內轉錄水平的變化，包括特異形式CREB蛋白活動水平的變化，對于突觸的長時程易化(long-term facilitation，LTF)是至關重要的[16]。有研究發現，CREB1基因可能是CREB、CREM和ATF1家族基因中唯一在海兔神經元中表達的成員。CREB1a蛋白是在長時程易化過程中的充分必需激活因子，而CREB1b則對CREB1a和長時易化起抑制作用[17]。有研究顯示，CREB1抗體能提升神經性疼痛大鼠縮爪閾值，同時降低c-fos的表達水平[18]。

本實驗研究觀察到，注射硝酸甘油后，CREB1a mRNA在三叉神經節和三叉神經脊束核表達水平明顯升高，給藥干預后在該部位表達水平明顯降低，以芎芷地龍湯7 d預防給藥組和舒馬普坦組下降明顯(P<0.01)。注射硝酸甘油后，CREB1b mRNA在三叉神經節和三叉神經脊束核表達水平明顯降低，給藥干預后在該部位表達水平明顯升高，芎芷地龍湯7 d預防給藥組和舒馬普坦組升高明顯(P<0.01)。而在硬腦膜和丘腦處，各組CREB1a mRNA和CREB1b mRNA的表達差異均無統計學意義(P>0.05)，這可能是因為硬腦膜無菌性炎癥被普遍認為是偏頭痛的關鍵發病環節[19]，以血管的擴張、血漿蛋白外滲、肥大細胞脫顆粒而使促炎性物質釋放，從而進一步激活分布于其上的初級傳入纖維，引起疼痛發生[20]。丘腦則被認為是處于傷害性信息的中央處理和整合的中心，被看作是處理傳入感覺信息的中轉中心，甚至能調節這些信息，并參與組成“痛感矩陣”，整合所有對疼痛的感受、情感和認知應答[9]，功能過于復雜。這也可能與CREB通過磷酸化發揮作用有關[21]，有研究證實，CREB磷酸化后可激活部分即早基因(如c-fos)的表達，激活對突觸功能起重要作用的參與痛覺傳導的物質如神經元型一氧化氮和腦源性神經營養因子[22]，同時也在神經病理性疼痛[23]和炎性疼痛[24]的病理過程中起著重要的作用，并在注射硝酸甘油或硝普鈉后表達增加[25]。因此，CREB在偏頭痛三叉神經血管通路中的作用還需進一步研究。

綜上所述，預防使用芎芷地龍湯可以減少硝酸甘油誘發的三叉神經節、三叉神經脊束核CREB1a mRNA表達，增加三叉神經節、三叉神經脊束核CREB1b mRNA表達，其中以預防給藥7 d組效果最好。