表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯對(duì)高脂飲食引起的高血脂大鼠的保護(hù)作用研究

血脂含量可以反映人體內(nèi)脂類代謝的情況，血漿三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)水平的升高即高脂血癥，特別是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度的升高，被認(rèn)為是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的重要因素，此外，還可直接導(dǎo)致心絞痛、心肌梗死和腦血栓、腦動(dòng)脈硬化等癥。動(dòng)脈粥樣硬化又是心肌梗死和腦梗死發(fā)病的主要因素之一[1-2]。高脂血癥病人應(yīng)注意科學(xué)飲食，少食高脂肪和高糖食物。綠茶因其藥理和營(yíng)養(yǎng)特性而聞名，是中國(guó)和東亞地區(qū)最受歡迎的飲料之一[3]，其主要化學(xué)成分是茶多酚(30%干重)[4]。多酚對(duì)包括癌癥、炎癥、糖尿病和心血管疾病在內(nèi)的病理狀況具有多種治療作用[5-6]。近年來，對(duì)多酚的科學(xué)興趣迅速增加，綠茶中的茶多酚含有大量的兒茶素，包括兒茶素、表兒茶素、表兒茶素-3-沒食子酸酯、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。在這些組分中，EGCG是茶多酚中最豐富的成分，與其他茶葉中的兒茶素相比，EGCG和ECG是生物活性研究最多的化合物[7]。EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。人們相信喝綠茶有益于健康，并且已經(jīng)證明EGCG在許多異常變化方面具有抑制作用，如抗氧化、抗癌、抗炎、抗膠原酶，抗纖維化作用，對(duì)成骨的促進(jìn)作用等[8-11]。盡管如此，目前關(guān)于EGCG的研究還處于起步階段，雖然普遍意識(shí)到EGCG有利于人體健康，但是很多藥理活性及其機(jī)制尚不明確，本研究旨在探討EGCG對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)大鼠膽固醇水平和血管反應(yīng)性的影響。

在臨床應(yīng)用EGCG預(yù)防及治療高脂血癥之前，需要明確其作用，并確定其作用機(jī)制。本研究旨在探討EGCG對(duì)膽固醇喂養(yǎng)大鼠血管反應(yīng)性改變的可能良性作用，以及EGCG對(duì)血漿膽固醇水平的降低作用與其是否存在相關(guān)性及對(duì)血管反應(yīng)性的影響，分析EGCG的降血脂活性和作用機(jī)制。

圖1 EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年Wistar大鼠，雌雄各半，SPF級(jí)，體重180～200 g，由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理要求和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 EGCG、氯乙酰膽堿、重酒石酸去甲腎上腺素和SNP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(純度≥99%)；其他試劑(分析純)購(gòu)于北京試劑廠。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為本實(shí)驗(yàn)室配制；蒸餾水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

1.3 儀器 X-20減震型閉循環(huán)低溫恒溫器(天津多為萊博科技有限公司)；16通道小動(dòng)物生理儀(BIOPAC公司)；Leica CM1520冰凍切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司)；DW-86L30超低溫冰箱(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)； Muromachi 尾套法血壓測(cè)定儀(香港生科儀有限公司)；微孔板讀數(shù)儀(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)；HNY-200B臺(tái)式全溫度恒溫高速培養(yǎng)搖床(北京傲松欣實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；Eppendorf-5424小型高速離心機(jī)(北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；Olympus SZ61/51 體視顯微鏡(奧林巴斯北京服務(wù)有限公司)；Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國(guó) Millipore 公司)。

1.4 動(dòng)物分組及給藥處理 雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為5組，每組12只，體重(200.0±20.5)g。大鼠飼養(yǎng)在空調(diào)動(dòng)物房?jī)?nèi)，人為控制時(shí)間周期為12 h光照/12 h黑暗。所有大鼠最初均喂飼標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飲食至少7 d，之后對(duì)照組繼續(xù)給予標(biāo)準(zhǔn)飲食(正常對(duì)照)。高脂飲食組飼喂標(biāo)準(zhǔn)飲食加0.5%膽固醇。大鼠自由攝取自來水。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分配至高脂飲食組和EGCG處理組(高、中、低劑量)，每天喂食不同劑量的EGCG。實(shí)驗(yàn)持續(xù)16周。每天監(jiān)測(cè)對(duì)照組和藥物治療組的食物攝入量。所有相關(guān)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)及操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.5 體重和生化指標(biāo)測(cè)定 從大鼠頸靜脈收集血液；每只大鼠在開始實(shí)驗(yàn)之前即稱體重，之后在高脂飲食或EGCG處理后每15 d測(cè)量并記錄體重。測(cè)定EGCG對(duì)血清TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)以及LDL-C。通過檢測(cè)試劑盒測(cè)定大鼠血清中卵磷脂膽固醇脂酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)、心肌脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)活性以及肝臟3-羥基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死大鼠，對(duì)心臟、肝臟和腎臟進(jìn)行稱重，并計(jì)算器官-體重比，以百分比表示。

1.6 離體血管取樣保存 經(jīng)過16周實(shí)驗(yàn)后，大鼠用乙醚麻醉并處死。將胸主動(dòng)脈快速移除并置于試劑中，Krebs-Henseleit溶液組成：NaCl 119 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，MgSO41.0 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L。

1.7 主動(dòng)脈環(huán)制備及血管反應(yīng)性測(cè)定 將附著于大鼠胸主動(dòng)脈的脂肪和周圍組織清理干凈，將動(dòng)脈切成2～3 mm寬的環(huán)。然后將主動(dòng)脈環(huán)懸掛在兩個(gè)不銹鋼鉤中，在10 mL Krebs Henseleit溶液中的臟器浴中。將溶液溫度保持在(36.0±0.5)℃，用95%O2-5%CO2氣體混合物連續(xù)噴淋。主動(dòng)脈環(huán)安裝在1 g張力下，用每種制劑平衡60 min，用力位移傳感器等距測(cè)量收縮反應(yīng)。等距力也通過MacLab A/D轉(zhuǎn)換器數(shù)字化，存儲(chǔ)并顯示在Macintosh計(jì)算機(jī)上。血管反應(yīng)性測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟：在平衡期后，主動(dòng)脈環(huán)與去甲腎上腺素(NE，10-6mol/L)收縮，當(dāng)收縮達(dá)到平臺(tái)時(shí)暴露于乙酰膽堿(ACh，10-8mol/L)或硝普鈉(SNP，10-8mol/L)以測(cè)試內(nèi)皮依賴性和獨(dú)立性。

2 結(jié) 果

2.1 EGCG對(duì)機(jī)體和臟器重量的影響 各組大鼠體重情況見圖2a，在實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠體重都增加，而各組別之間體重的數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心臟重量/體重比值見圖2b，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，與高脂飲食組相比，EGCG高、中、低劑量組的肝臟/體重比率均降低(見圖2c)。此外，腎臟重量/體重比值(見圖2d)在高脂飲食組大鼠中有顯著增加，而EGCG處理后可顯著降低腎臟重量/體重比。

C為對(duì)照組；M為高脂飲食組；1為EGCG低劑量組；2為EGCG中劑量組。3為EGCG高劑量組所有數(shù)據(jù)均為相對(duì)值，以對(duì)照組計(jì)為100%。與對(duì)照組相比，*P<0.05；與高脂飲食組相比，# P<0.05

2.2 EGCG對(duì)高脂飲食大鼠血脂的影響 在研究開始時(shí)，以血漿血脂濃度1.50 μmol/L計(jì)為100%，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束(16周)時(shí)，高脂飲食組顯著升高。EGCG組大鼠血漿TC均降低，且具有明顯劑量依賴性。詳見圖3。

C為對(duì)照組；M為高脂飲食組；1為EGCG低劑量組；2為EGCG中劑量組；3為EGCG高劑量組所有數(shù)據(jù)均為相對(duì)值，以對(duì)照組計(jì)為100%。與對(duì)照組相比，*P<0.05；與高脂飲食組相比，#P<0.05

圖3EGCG對(duì)大鼠血清血脂含量的影響

2.3 EGCG對(duì)高脂飲食大鼠血液流變學(xué)的影響 EGCG處理對(duì)NE(10-6mol/L)或KCl(80 mmol/L)誘導(dǎo)主動(dòng)脈收縮的影響。在每一組實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定NE(10-6mol/L)或KCl(80 mmol/L)引起的收縮，高脂飲食組動(dòng)脈內(nèi)皮素誘發(fā)的收縮較對(duì)照組明顯增加[(0.96±0.09)g與(1.28±0.08) g，P<0.05，n=8]。此外，EGCG處理組的收縮率高于高脂飲食組，EGCG低劑量組(RG-HP20-w)收縮率雖沒有顯著降低，但與高脂飲食組[(1.28±0.08)g 與(1.10±0.10)g]相比有所降低。

2.4 EGCG對(duì)高脂飲食大鼠血清中LCAT、HL、LPL的影晌(見表1)

組別只數(shù)LCATHLLPL對(duì)照組81.742±0.139 16.46±1.45 46.12±0.26高脂飲食組80.842±0.0351)8.51±0.471)21.18±0.261)EGCG低劑量組81.040±0.08712.24±0.8939.36±0.512)EGCG中劑量組81.361±0.1012)17.31±0.933)45.33±0.473)EGCG高劑量組81.746±0.1333)17.39±0.523)47.15±0.353)

與對(duì)照組相比， 1)P<0.05；與高脂飲食組相比，2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

高脂血癥是心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素之一。高血脂病人用藥要根據(jù)自身情況而定，但是臨床證明目前治療高脂血癥的藥物缺乏理想的作用，而且副作用明顯[12]。流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究提示，長(zhǎng)期食用高膽固醇食物易引起高TG、TC血癥。血清TG升高是冠心病的重要危險(xiǎn)因素，LDL -C水平升高與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率呈正相關(guān)，而HDL-C具有消除膽固醇的作用[13]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，茶葉全球年銷售額超過430億美元，其中超過110億美元是綠茶[14]。越來越多的證據(jù)表明，綠茶及其成分對(duì)健康有各種潛在的益處，近年來，以膠囊和片劑形式的各種即飲綠茶飲料和食品補(bǔ)充產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)，更多地接觸到傳統(tǒng)釀造綠茶的消費(fèi)。綠茶對(duì)人體健康的益處集中在建立綠茶和/或其生物活性成分的飲食指導(dǎo)，雖然多酚類化合物廣泛存在于許多食物和飲料中，包括水果、蔬菜、茶和葡萄酒，但是EGCG在綠茶中的含量遠(yuǎn)高于其他食物，是綠茶中最有代表性的化合物。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂食大鼠復(fù)制高脂血癥模型，給予EGCG治療后，大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低，證明EGCG具有良好的降低TC、TG的作用，對(duì)于高脂血癥大鼠血清LDL-C 升高、HDL-C降低的脂質(zhì)代謝紊亂，具有明顯的改善作用，可以顯著改善高脂飲食大鼠體內(nèi)的血脂增高現(xiàn)象。本研究為臨床治療高脂血癥所需的新的藥物或其類似物的發(fā)現(xiàn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。