血漿hsa-miR-19a-3p表達與急性心肌梗死的相關性研究

黃 浩，陳文江2，劉長召，王 玲，王鳳萍

冠心病(coronary artery disease， CAD)主要是指冠狀動脈發生動脈粥樣硬化所導致的心臟疾病，給病人及家庭、社會帶來了沉重負擔，尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，為CAD中最嚴重的類型，其發病率逐年升高，為臨床常見的心血管疾病之一，具有較高的死亡率和致殘率[1-2]。據我國最新心血管疾病報告顯示：我國 AMI 死亡率城市為 55.32/10萬人， 農村為68.60/10 萬人，而AMI 死亡率均隨年齡的增高而增加，由此可見其防治顯得十分重要[3-4]。目前，對于AMI的防治主要是對危險因素(高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、肥胖、大氣污染和不合理膳食等)的控制和早診斷、早發現、早治療[5]。關于AMI的診治，目前主要依靠于臨床癥狀、心電圖和心肌酶譜等綜合評估，然而我國AMI病人的診治普遍較晚，從入院到接受急診再灌注治療時間存在很大的差異，入院到接受急診冠狀動脈介入治療的中位時間為 165 min，從入院到溶栓時間為 130 min，主要可能與醫院硬件設施和診斷標志物水平檢測等有關。近年來，發現了一些新型的AMI生物診斷標志物，如超敏C反應蛋白、脂蛋白相關磷脂酶A2、血清卵泡抑素樣蛋白1和循環微小RNA(microRNA， miRNA)等[6-9]，尤其是循環miRNA(主要是指血清、血漿和尿液等中的miRNA)與AMI的研究成為熱點，有研究發現miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等[10-15]均可能與AMI發病密切相關，并可作為AMI的診斷標志物，然而各個研究納入人群(種族、年齡和病史等)、樣本量和檢測方法等都不同，因而結論也尚未達成一致，還有待進一步研究。本研究擬對血漿hsa-miR-19a-3p進行檢測，探討其與AMI的相關性，并與傳統心肌標志物進行比較分析，以期發現更有效的心肌損傷診斷標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選2015年5月—2016年10月CAD病人90例作為研究對象，其中AMI組45例，穩定型冠心病(SCAD)組45例，所有病人于入院6 h內以EDTA抗凝管抽取2 mL 靜脈血；另外，對行經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)術的AMI病人在術后1 d和3 d各收集2 mL 靜脈血，并于4 h內進行離心(3 000 r/min，4 ℃，10 min)分離血漿，保存于-80℃冰箱，以備后續實驗用。同時，收集病人入院時基本病史和生化檢測指標等臨床資料。

1.2 CAD診斷標準 按照《中國經皮冠狀動脈介入治療指南(2016)》[16]進行診斷和分類。入選標準[9]：經冠狀動脈造影(CAG)證實3支主要冠狀動脈中至少一支冠狀動脈管腔狹窄>50%；行急診PCI的AMI病人；心電圖和傳統心肌標志物符合AMI診斷。SCAD包括以下3類病人：慢性穩定性勞累型心絞痛；既往已明確診斷有冠心病或者最近發生休息時心絞痛，但經治療后疼痛消失，需定期隨訪的穩定病人(包括變異型心絞痛、低危不穩定型心絞痛、微血管性心絞痛)；無癥狀或者有“缺血相當”癥狀(氣急、左心室功能不全等)的缺血性心臟病病人。

1.3 排除標準 惡性腫瘤、腦卒中、外周血管疾病、肝腎功能不全、急性感染及患其他慢性器質性疾病病人。

1.4 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測 采用ELISA測定血漿肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌紅蛋白(MYO)和肌鈣蛋白I(cTnI)，按照試劑盒說明書進行相關具體步驟檢測。

1.5 血漿hsa-miR-19a-3p的qRT-PCR檢測 采用miRNAcute miRNA提取分離試劑盒(廣州真知生物有限公司)柱式分離提取并純化其miRNA，然后按照其配套的miRNAcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(廣州真知生物有限公司)將miRNA逆轉錄合成cDNA，最后按照miRNAcute miRNA SYBR Green熒光定量檢測試劑盒(廣州真知生物有限公司)及試劑盒中的下游引物進行熒光定量檢測。hsa-miR-19a-3p(MIMAT0000073，UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA)的上游引物和內參U6引物(廣州真知生物有限公司提供)，下游引物為試劑盒通用引物。所有操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行，熒光定量過程：94 ℃變性2 min；PCR循環中模板94 ℃變性20 s；60 ℃退火、延伸34 s；共30個循環。本研究采用2-ΔCt相對定量方法進行數據分析：ΔCt(實驗組)=Ct(實驗組目標基因)-Ct(實驗組內參基因)；ΔCt(對照組)=Ct(對照組目標基因)-Ct(對照組內參)。

2 結 果

2.1 入選研究人群基本特征情況 本研究共納入90例研究對象，兩組研究對象在年齡、性別、吸煙史、高血壓等基本病史方面比較差異無統計學意義(P>0.05)；在β受體阻滯劑等基本心血管相關藥物服用方面比較差異無統計學意義(P>0.05)；入院時血清肌酐和血糖比較差異無統計學意義(P>0.05)；AMI組的脂蛋白a、總膽固醇和低密度脂蛋白與SCAD組比較差異有統計學意義(P<0.05)；AMI組心肌標志物CK-MB 、MYO、cTnI與SCAD組比較明顯升高(P<0.000 1)。詳見表1。

表1 入選研究人群基本病史和生化檢查情況比較

注：BMI為體質指數；CCB為鈣通道阻滯劑；ACEI為血管緊張素轉換酶抑制劑；ARB為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑

2.2 血漿中hsa-miR-19a-3p表達與CK-MB、MYO、cTnI的相關性 AMI組血漿hsa-miR-19a-3p水平(0.20±0.02)較SCAD組(0.05±0.01)明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1A。經過Pearson相關分析發現：血漿hsa-miR-19a-3p的表達水平與CK-MB的Pearson相關系數為0.488 1，95%置信區間(confidence interval，CI)為0.312 5～0.631 4(P<0.000 1)。詳見圖1B。與MYO的Pearson相關系數為0.457 0，95%CI為0.275 9，0.606 7(P<0.000 1)。詳見圖1C。與cTnI的Pearson相關系數為0.452 2，95%CI為0.270 3～0.602 8(P<0.000 1)。詳見圖1D。

圖1 血漿hsa-miR-19a-3p表達及其與CK-MB 、MYO、cTnI的相關性

2.3 血漿hsa-miR-19a-3p、CK-MB 、MYO和cTnI的ROC曲線 血漿hsa-miR-19a-3p的 ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)=0.895 3，95%CI(0.825 1，0.965 6)，P<0.000 1。詳見圖2A。CK-MB的AUC=0.854 8，95%CI(0.774 7，0.934 9)，P<0.000 1。詳見圖2B。MYO的 ROC曲線的AUC=0.932 3，95%CI(0.881 6，0.983 1)，P<0.000 1。詳見圖2C。cTnI的ROC曲線的AUC=0.948 6，95%CI(0.901 6，0.995 7)P<0.000 1。詳見圖2D。hsa-miR-19a-3p截斷值(cut-off)為 0.029 8，其靈敏度為44.44%(29.64%～60.00%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；CK-MB的cut-off值為1.884 U/L，其靈敏度為22.22%(11.20%～37.09%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；MYO的cut-off值為4.927 ng/mL，其靈敏度為53.33%(37.87%～68.34%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；cTnI的cut-off值為2.897 ng/L，其靈敏度為57.78%(42.15%～72.34%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)。

2.3 AMI病人PCI術前、術后血漿中hsa-miR-19a-3p表達情況 對AMI病人行PCI術前、術后1 d及術后3 d血漿中hsa-miR-19a-3p分析發現，PCI術前血漿hsa-miR-19a-3p的表達(0.245 7±0.028 1，n=45)與術后1 d(0.195 0±0.026 1，n=42)比較差異無統計學意義(P>0.05)，而術后3 d血漿hsa-miR-19a-3p的表達(0.071 1±0.008 9，n=40)較術前比較則明顯下降(P<0.05)。詳見圖3。

圖2 血漿hsa-miR-19a-3p、CK-MB 、MYO和cTnI的ROC曲線

與術后3 d比較，*P<0.05

2.4 AMI病人血管病變支數與血漿hsa-miR-19a-3p表達情況比較 本研究共納入AMI病人45例，經過CAG和PCI發現，其中冠狀動脈單支病變病人17例，雙支病變病人16例，而三支病變病人12例，通過分析發現：三支病變病人血漿中hsa-miR-19a-3p表達(0.130 4±0.007 3)，明顯比雙支病變(0.213 3±0.038 4)和單支病變(0.269 8±0.051 4)升高，差異具有統計學意義(P<0.000 1)；且雙支病變病人hsa-miR-19a-3p表達水平與單支病變病人比較也明顯升高(P<0.000 1)。詳見圖4。

與單支病變比較，*P<0.000 1；與雙支病變比較，#P<0.000 1

3 討 論

miRNA為一類長約22個堿基的非編碼RNA，目前研究發現，大量miRNA廣泛參與生物體的各種生理過程和病理過程，大量miRNA可能參與了心血管系統的發育和心血管疾病的發生、發展過程。AMI為危害人類健康的災難性疾病，其防治隨著近年來診治水平(PCI和溶栓治療)的開展取得了顯著成效，然而我國AMI發病率和死亡率仍然呈逐年升高的趨勢，因而對AMI防治研究仍然十分重要。隨著miRNA研究的逐漸深入，發現miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等都可能與心血管疾病密切相關，尤其是循環miRNA的發現，為miRNA的研究開辟了新方向。有研究表明大量循環miRNA可能與腫瘤系統疾病、神經系統疾病、呼吸系統疾病和消化系統疾病等有關，近年來發現循環miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等可以作為AMI的診斷生物標志物[17-21]。然而，循環miRNA作為標志物在臨床的應用卻很少，主要是因為各個研究納入人群不同、采用檢測方法不同和檢測的miRNA也不一樣，所以導致循環miRNA的應用未被推廣。雖然未被推廣，但是循環miRNA作為疾病診斷標志物的研究仍具有前景，隨著大量研究的深入開展，有Meta分析顯示，miR-499對AMI的總體敏感性為88%[95%CI(0.86，0.90)，P<0.000 1]；特異性為0.87 [95%CI(0.84，0.90)，P<0.000 1]；miR-1對AMI的總體敏感性為63% [95%CI(0.59，0.66)，P<0.000 1]；特異性為76% [95%CI(0.71，0.80)，P<0.000 1]；miR-133a對AMI的總體敏感性為89%[95%CI(0.83，0.94)，P=0.004 7]；特異性為87%[95%CI(0.79，0.92)，P=0.026 2]；miR-208b對AMI的總體敏感性為78%[95%CI(0.76，0.81)，P=0.058 1]；特異性為88%[95%CI(0.84，0.91)，P<0.000 1]；說明循環miRNA確實具有作為診斷疾病生物標志物的潛能[22-23]。

本研究發現，AMI組血漿hsa-miR-19a-3p水平較SCAD組明顯升高(P<0.05)，發現其與CK-MB的Pearson相關系數為0.488 1(P<0.000 1)，與MYO的Pearson相關系數為0.457 0(P<0.000 1)，與cTnI的Pearson相關系數為0.452 2(P<0.000 1)；并發現血漿hsa-miR-19a-3p的AUC為0.895 3(P<0.000 1)，其靈敏度為44.44%(29.64%～60.00%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；CK-MB的AUC為0.8548(P<0.000 1)，靈敏度為22.22%(11.20%～37.09%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；MYO的AUC為0.932 3(P<0.000 1)，靈敏度為53.33%(37.87%～68.34%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；cTnI的AUC為0.948 6(P<0.000 1)，其靈敏度為57.78%(42.15%～72.34%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)，由此可見，血漿hsa-miR-19a-3p可能與AMI的發病有關，在AMI中呈現明顯差異性表達，而且可以作為AMI的診斷標志物，具有較高特異性。

同時發現血漿hsa-miR-19a-3p在PCI術后3 d明顯下降，可能具有判斷AMI病人預后的價值；通過冠狀動脈主要血管病變數量分析發現，三支病變病人血漿中hsa-miR-19a-3p表達明顯比雙支病變和單支病變病人升高(P<0.000 1)；而且雙支病變病人hsa-miR-19a-3p表達水平與單支病變病人比較也明顯升高(P<0.000 1)，該結果說明血漿hsa-miR-19a-3p的表達可能與AMI病人心臟血管病變數量有關，可能具有反映心臟病變程度的潛力。

然而，本研究只是一個小樣本的研究，還有待大樣本實驗的進一步驗證；而且發現血漿hsa-miR-19a-3p在AMI組和SCAD組的明顯差異性表達，然而其可能機制還未進行探討和探究。本研究顯示，血漿hsa-miR-19a-3p作為AMI標志物的敏感性較低，但是特異性并不低于傳統心血管心肌酶。隨著非編碼RNA研究的深入，長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs， lncRNAs)和環狀RNA(Circular RNAs， circRNAs)等新型非編碼RNA也被發現，而且發現lncRNAs和circRNAs也與心血管疾病的發生密切相關，也發現了部分lncRNAs和circRNAs可以作為心血管疾病的診斷標志物[24-27]，如果能夠結合miRNAs、lncRNAs和circRNAs共同來作為生物標志物，可能具有更大意義，也可能揭示心血管疾病新的發病機制，為心血管防治開辟新途徑和新方法。

綜上所述，血漿hsa-miR-19a-3p可能與AMI發病密切相關，并可以作為AMI的新型診斷生物標志物。