血紅素加氧酶1對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用

楊 諾，李 文

(1.首都醫科大學第一臨床醫學院，北京 100069； 2.首都醫科大學基礎醫學院細胞生物系，北京 100069)

缺血再灌注損傷是一種常見的病理反應，指組織或器官因血管局部或完全阻塞導致一定時間的缺血，血流恢復后對組織或器官造成的損傷[1]。肝臟是生物體的生化工廠，耗能量大，其功能很大程度上依賴氧氣的供應，容易受缺血或缺氧的影響。肝臟缺血再灌注損傷指在缺血前提下，肝臟血流恢復后組織損傷加重，甚至造成不可逆損傷的現象。局部缺血根據缺血發生時的溫度分為熱缺血(37 ℃)和冷缺血(4～7 ℃)[1]。臨床上，心肌缺血、休克、創傷和手術中可觀察到熱缺血，肝切除和肝臟移植術中冷缺血更為常見。肝臟缺血再灌注損傷是肝移植術后肝功能障礙和肝衰竭的重要原因，也見于肝臟部分切除術、出血性休克等多種臨床病理過程和肝臟手術過程[2]。近年來，減輕移植肝缺血再灌注損傷一直是臨床關注的熱點。有研究表明，血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)-1作為內源性防御分子，通過抗氧化、抗凋亡、抗炎癥、促自噬等作用發揮對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用，同時對脂肪肝的缺血再灌注損傷也有保護作用[2]。現就HO-1對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用予以綜述。

1 肝臟缺血再灌注損傷機制

1.1細胞內鈣超載 生理情況下，細胞內維持穩定的鈣離子濃度。肝臟缺血時，組織處于缺血、缺氧狀態，細胞內ATP迅速消耗，無氧酵解增強，乳酸等酸性代謝物積累，同時線粒體的氧化磷酸化能力下降，導致代謝性酸中毒。此時，ATP依賴的鈉鉀ATP酶在細胞膜內的活性降低，導致細胞內鈉離子濃度升高以及鈉離子和鈣離子的反向轉運增強；此外，缺血和缺氧會增加細胞膜的滲透性，鈣離子進入細胞增多，同時線粒體、內質網膜結構破壞，導致細胞內鈣超載[3]。鈣超載可通過多種機制引起肝損傷。鈣超載可引起肝細胞線粒體功能障礙，ATP合成減少，線粒體水腫，線粒體膜通透性改變引起凋亡信號溢出，激活胱天蛋白酶級聯反應，導致細胞凋亡或壞死；細胞內鈣離子增多可以激活磷脂酶類，損傷細胞膜結構；細胞鈣超載還可激活某些ATP酶，導致細胞高能磷酸鹽水解，釋放出大量氫離子，加重細胞酸中毒。

1.2氧自由基(oxygen free radicals，OFR)損傷 OFR是以氧為中心的自由基，包括過氧化氫、超氧陰離子、羥自由基等。機體生理狀況下能夠不斷產生并且清除OFR，使其處于動態平衡狀態[4]。OFR的大量產生是肝臟缺血再灌注損傷的關鍵環節。缺血時細胞內ATP減少，膜泵功能障礙，鈣離子進入細胞后增強鈣依賴性蛋白酶活性，促進黃嘌呤脫氫酶轉變成黃嘌呤氧化酶；同時，細胞內氧分壓低，ATP的降解產物次黃嘌呤大量堆積[5]。再灌注時，大量分子氧進入，黃嘌呤氧化酶催化次黃嘌呤轉化為黃嘌呤和尿酸的過程中產生大量OFR。此外，由于再灌注時線粒體氧化磷酸化功能障礙而形成較多的OFR，再灌注激活庫普弗細胞、中性粒細胞的吞噬作用，其耗氧量顯著增加，呼吸爆發，生成大量OFR。OFR使膜脂質過氧化增強，破壞細胞器膜結構，進而引起溶酶體、微粒體及線粒體破裂，從而直接損傷細胞，并對蛋白質、核酸、膠原和多糖等有毒性作用。

1.3炎癥反應 再灌注早期庫普弗細胞活化和晚期中性粒細胞活化介導的炎癥反應是肝臟缺血再灌注損傷的重要環節。再灌注早期，庫普弗細胞在Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)的參與下，激活并上調介導炎癥反應的細胞因子的表達，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，白細胞介素(interleukin，IL)-1，對觸發炎癥級聯反應有重要作用[6]。庫普弗細胞的產物可以活化和聚集CD4+T淋巴細胞，損傷肝細胞、肝竇內皮細胞，并導致微循環障礙[7]。此外，缺血產生的大量趨化因子使中性粒細胞生成、并向肝臟聚集和活化，再灌注時中性粒細胞繼續大量聚集而加重損傷。激活的中性粒細胞產生大量的OFR，并分泌大量炎癥細胞因子等損傷肝組織，導致肝功能障礙[4]。

1.4微循環障礙 肝血竇內皮細胞對缺血再灌注損傷敏感，缺氧可引起內皮細胞能量代謝失衡和細胞凋亡。再灌注過程中，增多且激活的中性粒細胞黏附在血管內皮細胞上，易嵌頓、堵塞微循環血管，并在細胞因子P-選擇素的作用下，大量血小板聚集、黏附于缺血組織，形成微血栓。再灌注時缺血區無法得到充分的血液灌注，此現象稱為無復流現象。內皮細胞功能障礙引起血管收縮舒張失調，肝臟微循環功能障礙會加重肝臟的缺血缺氧癥狀，引起肝竇內皮細胞死亡，造成肝組織的不可逆損傷。

1.5細胞凋亡和壞死 線粒體膜通透性的改變可以引起凋亡信號的溢出，導致程序性細胞死亡或壞死。細胞缺血期間，由于ATP缺乏，物質轉運受到影響，產生的有毒代謝物不能及時轉運，導致細胞腫脹。再灌注期間，ATP合成不足、活性氧大量產生及炎癥損傷都會導致細胞壞死或凋亡[3]。

2 HO概述

HO是所有真核生物細胞內普遍存在的酶，是細胞內血紅素分解的關鍵限速酶，通過有氧氧化將血紅素降解為膽綠素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和游離鐵，膽綠素又進一步被還原為膽紅素。HO有3種同工酶，HO-1為可誘導型HO同工酶，HO-2和HO-3呈組成型大量表達。HO-2與HO-1的氨基酸序列僅有40%同源性，主要存在于大腦和睪丸組織。HO-3與HO-1的氨基酸結構僅有43%相似，與HO-2的氨基酸結構有90%同源性，催化血紅素分解的活性較HO-1和HO-2明顯減弱。

HO-1也稱熱激蛋白32，人類HO-1基因位于染色體22q12上，包含5個外顯子和4個內含子。生理情況下，HO-1廣泛表達于各種組織細胞的微粒體內，主要存在于脾臟和肝臟組織，脾臟中表達量最多，其余組織含量低。HO-1的表達具有可誘導性，多種引起細胞氧化應激的因素均可誘導其表達，如缺氧、缺血再灌注、內毒素、炎癥因子等[8]。

3 HO-1對肝臟缺血再灌注損傷的保護機制

3.1抗氧化作用 HO-1氧化血紅素需要消耗氧氣，可在缺血再灌注過程中減少由氧氣產生的OFR，起到抗氧化作用。Yun等[9]對肝臟缺血再灌注損傷過程中HO-1的表達和活性變化的研究發現，缺血1 h的大鼠肝臟，再灌注1 h后HO-1活性增加，4～6 h的HO-1活性最高，隨后逐漸下降。HO-1信使RNA和蛋白的表達也在再灌注1 h后升高，再灌注6 h達到最高，隨后下降。大鼠肝臟HO-1的變化趨勢與肝功能丙氨酸轉氨酶的變化趨勢一致。HO-1誘導劑高鐵血紅素處理組較注射等量0.9%氯化鈉注射液對照組血清丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶水平降低，超氧化物歧化酶表達增高，丙二醛含量降低，谷胱甘肽含量增加，同時Sestrin2(Sesn2)蛋白表達增加，肝臟組織學病變減輕；而HO-1抑制劑鋅原卟啉處理組較注射等量0.9%氯化鈉注射液對照組血清丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶水平增高，組織學病變加重，丙二醛含量升高，谷胱甘肽含量減少，表明HO-1對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用與抗氧化作用有關[10]。氧化應激時，多種轉錄因子(如核因子E2相關因子2、核因子κB，轉錄激活因子-1等)可以激活HO-1基因的表達[11]。如OFR通過促分裂原活化的蛋白激酶途徑使核因子E2相關因子2磷酸化，啟動HO-1基因轉錄，提高HO-1的表達量[12-13]。

血紅素氧化產物膽綠素及其轉化產物膽紅素是體內的抗氧化劑，可起到抗氧化損傷的作用；膽紅素可抑制細胞膜脂質過氧化，減輕OFR對血管內皮細胞和平滑肌細胞的損傷[8]。HO-1降解血紅素卟啉環釋放Fe2+，誘導鐵蛋白合成，限制Fe2+參與Fenton反應，減少生成OFR，鐵蛋白的抗氧化作用可抑制鐵與過氧化氫反應，減少OFR的毒性作用[4]。

3.2抗凋亡作用 HO-1可通過多種途徑抑制肝臟細胞凋亡，減輕再灌注時肝損傷。缺血后再灌注期間，HO-1可增加抗凋亡基因Bcl-2表達，抑制胱天蛋白酶3級聯反應，從而減少細胞凋亡[14]。Wang等[15]對鋅原卟啉處理小鼠的研究發現，HO-1表達下調，線粒體凋亡通路激活，引發胱天蛋白酶3級聯反應，導致細胞凋亡，加重肝臟缺血再灌注損傷。HO-1可抑制肝臟缺血再灌注損傷時腫瘤壞死因子-腫瘤壞死因子受體1介導的凋亡信號，減少細胞凋亡。HO-1表達增加時死亡誘導信號復合體減少，腫瘤壞死因子受體1相關死亡結構域蛋白、Fas相關死亡結構域蛋白和胱天蛋白酶8表達降低，細胞凋亡受到抑制[16]。內質網是分泌蛋白質合成和折疊的細胞器，缺血再灌注時內質網出現應激，應激蛋白表達升高，促進細胞凋亡。HO-1還可降低肝臟缺血再灌注時內質網應激蛋白CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白的表達，可見HO-1可降低缺血再灌注時內質網應激引起的細胞凋亡[17]。

血紅素氧化產物CO可活化p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑來抑制CD95/FasL介導的肝細胞外源性凋亡途徑，也可通過調節促凋亡基因(如Bax、p53)與抗凋亡基因(Bcl-2)的表達發揮抗凋亡作用[18]。膽綠素可增加抗凋亡因子的表達，此外，重鏈鐵蛋白也有抗凋亡作用。

3.3抗炎癥作用 HO-1可抑制缺血再灌注時的炎癥反應。肝臟缺血再灌注時，肝臟巨噬細胞HO-1表達增加，抑制炎癥反應。肝臟缺血再灌注后，淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等浸潤減輕，肝臟炎癥細胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6)以及趨化因子CXCL-1和CXCL-2表達降低[19-20]。骨髓HO-1表達可以調節巨噬細胞的極化，使促炎M1型表達減少，抗炎M2亞型表達增多，從而發揮抗炎作用[21]。

HO-1的抗炎癥作用與抑制天然免疫受體TLR2和TLR4信號通路的活化有關。HO-1激動劑鈷原卟啉預處理的肝臟缺血再灌注后，TLR2、TLR4、IL-1受體相關激酶、TNF受體相關因子6的表達下降，信號通路相關激酶(如干擾素調節因子-3、p38促分裂原活化的蛋白激酶、人核因子κB抑制蛋白-α)的磷酸化水平下降，表明其可減弱缺血再灌注時天然免疫細胞的活化。有研究發現，在肝臟缺血再灌注中，HO-1通過HO-1-信號傳導及轉錄激活因子3軸抑制TLR4介導的天然免疫炎癥反應，激活磷脂酰肌醇-3-激酶/PTEN信號通路，從而發揮抗炎作用[22]。腺病毒載體Ad-HO-1轉染可以減輕肝臟缺血再灌注損傷，伴有信號傳導及轉錄激活因子3的表達升高、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路激活和PTEN基因抑制。若預先使用磷脂酰肌醇-3-激酶抑制劑，則腺病毒載體Ad-HO-1轉染不能減輕缺血再灌注造成的炎癥反應，由此可見，TLR4-核因子κB途徑受磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路的調節，抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路可以促進TLR4-核因子κB活化，促進肝臟炎癥反應[22]。

血紅素的代謝產物膽綠素可調節血管內皮細胞黏附因子表達，減少肝臟缺血再灌注損傷的中性粒細胞浸潤，抑制IL-6、IL-1β、TNF-α及細胞間黏附分子-1的釋放，還能夠抑制補體系統，從而減輕炎癥反應造成的損傷[8]。

低濃度CO可活化p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑調節巨噬細胞源性促炎分子，并促進抗炎細胞因子IL-10分泌，在缺血再灌注損傷中發揮抗炎癥作用[18]。

3.4改善微循環 肝血竇內皮細胞易在缺血再灌注損傷中受損，引起微循環紊亂。血管HO-1可減少血小板向肝血竇內皮細胞的黏附和庫普弗細胞的黏附，肝血竇內血小板流速增加[23]。

血紅素的代謝產物CO可在一定程度上改善缺血再灌注過程的微循環，CO通過p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑和環鳥苷酸途徑舒張血管平滑肌，改善微循環[18]。少量CO可減少白細胞在肝竇處的聚集，減少肝細胞損傷，并在一定程度上恢復微循環。

3.5促進細胞自噬 哺乳動物自噬是一種細胞內自我消化途徑，在溶酶體內清除長壽蛋白、受損細胞器和畸形蛋白。自噬是氧化應激過程中細胞的一種適應機制，可通過降解細胞內容物來促進肝細胞生存，以維持ATP的產生并清除受損細胞器和蛋白聚集物[24]。研究發現，小鼠肝臟缺血1 h以及再灌注后1～4 h，自噬均受到抑制，表現為自噬標志物(膜型自噬微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ與胞質型自噬微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ的比值)下降，p62蛋白水平升高，電鏡下自噬體減少。肝細胞內鈣離子濃度升高可抑制肝臟自噬，激活鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2，并降解自噬相關蛋白。Hemin預處理可以減輕肝臟缺血再灌注損傷，伴自噬水平提高，與HO-1抑制鈣蛋白酶2活性有關。而鋅原卟啉預處理可使肝臟缺血再灌注損傷增加，自噬受到抑制，表明誘導HO-1表達可以通過抑制鈣蛋白酶2活性，提高自噬水平，保護肝臟缺血再灌注損傷[25]。肝臟缺血再灌注損傷模型中，缺血預處理可以減輕肝臟缺血再灌注損傷，其機制與肝細胞內HO-1生成增多以及細胞自噬增加有關，從而清除功能障礙的線粒體，降解錯誤折疊的蛋白質，抑制ROS的產生，減輕內質網應激反應并減少肝細胞凋亡、壞死[26]。多項研究發現，誘導核因子E2相關因子2/HO-1防御通路的激活，可增加細胞自噬，減輕肝臟缺血再灌注損傷[27-30]。

對小鼠原位肝移植模型的研究發現，體外存放20 h，并輸注轉染了Ad-HO-1的骨髓源性巨噬細胞的供肝移植，可以減輕移植后肝損傷，表現為肝臟功能改善，肝細胞凋亡減少，肝臟炎癥細胞因子表達下降，肝細胞自噬增加；進一步研究發現，HO-1促進自噬保護移植肝臟的作用與激活沉默信息調節因子1有關，抑制沉默信息調節因子1活性可以抑制自噬，減弱HO-1過表達對肝移植的保護作用[31]。

3.6其他保護途徑 在肝臟缺血再灌注損傷中，HO-1可以通過調控線粒體質量控制,減輕肝臟缺血再灌注損傷，如增加線粒體DNA含量和線粒體轉錄因子A蛋白表達、增強線粒體的生物合成、促進Parkin蛋白的表達及線粒體自噬、減少缺血再灌注時線粒體分裂相關蛋白Drp1的表達、抑制線粒體分裂以及促進線粒體動態平衡[32]。線粒體質量控制與激活磷酸甘油酸變位酶5信號通路有關。

HO-1能誘導缺氧誘導因子-1α、趨化因子CXCL12a和血管內皮生長因子的表達，動員血管內皮祖細胞從骨髓向外周血釋放，并向肝臟內遷移，促進肝內和肝外膽道周圍血管叢損傷的修復和再生，有助于缺血再灌注損傷后的修復[33]。

4 小 結

HO-1及血紅素的代謝產物膽綠素、CO、Fe2+在細胞抗氧化損傷、抗凋亡壞死、抗炎癥反應、改善微循環等方面具有重要作用，在減輕肝移植后肝損傷方面具有巨大的應用潛力，但其大規模應用尚需要解決很多問題。目前，尚未找到誘導HO-1表達的最佳方法。如體內腺病毒介導的HO-1基因轉移，由于沒有組織表達特異性，會產生非特異性誘導的HO-1，可能給機體帶來不利影響。HO-1的細胞保護效應有一定的劑量范圍，超過范圍可能有細胞毒性。鈷原卟啉誘導全身HO-1過量表達可增加肝損傷，加重細胞壞死和纖維化。庫普弗細胞是肝臟HO-1的主要來源，HO-1的表達增加也可能加重庫普弗細胞的活化，從而增加炎癥和成纖維介質的形成。

血紅素代謝產物CO可作為缺血再灌注損傷的治療，但需注意CO用量，高水平CO吸入對身體有害，甚至危及生命。膽綠素也可用于臨床缺血再灌注損傷的治療，但過多膽綠素可代謝生成膽紅素，膽紅素過多會引起神經毒性，并作為溶菌劑與紅細胞膜結合，影響機體正常生理活動。綜上所述，HO-1及其代謝產物對肝臟缺血再灌注損傷具有多方面的保護作用，但將HO-1及血紅素代謝產物應用于臨床治療時，需同時考慮其細胞保護性和細胞毒性，謹慎選擇治療方案。