PAD4功能的研究進展及臨床意義

茍峻琦，劉 茂,唐 鍇，帥 壯，呂 湛

(川北醫學院附屬醫院心內科，四川 南充 637000)

肽酰基精氨酸脫亞氨酶4(peptidylarginine deiminases 4，PAD4)是一種在Ca2+存在條件下可將肽酰精氨酸殘基轉變為肽酰瓜氨酸殘基的修飾酶，是蛋白質翻譯后重要的修飾方式之一。PAD4參與多種疾病的發病過程[1]。PAD4首先在白血病中發揮作用而被發現[2]，隨后大量的研究發現其可通過直接作用參與腫瘤細胞增殖和轉移、自身免疫性疾病以及急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndromes，ACS)發病過程，同時也可通過促進中性粒細胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)形成在多種疾病中發揮間接作用[3-5]。NETs由染色質與顆粒蛋白質構成，DNA是NETs的主要結構成分。NETs最初被描述為一種防御細菌的機制[6]，研究發現其在病理血栓形成(包括深靜脈血栓形成[7]和動脈粥樣硬化血栓形成[8])、自身免疫性疾病的發生、腫瘤的發生中同樣具有重要作用。因此，PAD4抑制劑或降解NETs的藥物可能成為治療心血管疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等疾病的新方法。現就PAD4的生物學功能及其臨床意義進行綜述，期望對PAD4深入研究、相關臨床疾病的診斷以及開發新的藥物提供幫助。

1 PAD4的結構

Chavanas等[9]將位于染色1p35～36上編碼5種人PAD的基因分別稱為PAD1～4與PAD6。Nakashima和Hagiwara[2]首先報道從人骨髓白血病HL-60細胞中發現PAD4，其是由663個氨基酸組成的共價二聚體，cDNA為2 238 bp，分子量為74 000。PAD4主要分布于巨噬細胞、粒細胞與單核細胞的細胞質中，作用于細胞核中的組蛋白,它能將帶正電荷的組蛋白精氨酸轉化為電中性的瓜氨酸殘基，進而減弱組蛋白與負電荷DNA的相互作用，使染色質疏松、核膜破裂，釋放出松散的染色質和顆粒蛋白，最終形成網狀結構。Manjula和Masashi[10]研究發現PAD4是PAD家族中唯一具有核定位模體特性，其能定位于細胞核且在細胞分化、發育和凋亡中發揮重要作用。當PAD4被Ca2+激活時，其能定位于細胞核，以瓜氨酸作用于H3、H2A、H4[6]。PAD4具有兩個結構域的伸長折疊，N-結構域由氨基酸殘基Met1至Pro300組成，可進一步分化為兩個免疫球蛋白樣亞結構域(亞結構域1和2)。亞結構域1(殘基1～118)具有9個b-片層和1個核定位信號，亞結構域2(殘基119～300)有10個b-片層、4個短的α-螺旋和3個Ca2+結合位點。Asn301至Pro663構成C-結構域，C-結構域有5個bbab模塊化結構，其結構以一種假五倍體對稱結構(稱為a/b螺旋片,a/b propeller)環形排列，形成活性位點裂隙。活性位點裂隙能容納組蛋白N端肽和兩個Ca2+結合位點[11]。PAD4是一種依賴Ca2+活性酶，有5個Ca2+結合位點，其與Ca2+結合可引起本身構象改變，形成活性位點裂隙。

2 PAD4的功能

2.1PAD4在ACS中的作用 ACS主要由斑塊破裂引起，斑塊破裂是動脈粥樣硬化斑塊內炎癥形成的結果，炎癥將促進壞死核心的擴張和纖維帽的變薄。目前全世界主要的治療手段是針對傳統的風險因素，如血漿低密度脂蛋白膽固醇水平、吸煙和高血壓，蝕損斑塊對ACS的影響正在上升。蝕損斑塊的特征是內皮細胞脫落和小血管腔內血栓形成，占所有ACS的25%～30%[12]。PAD4通過催化NETs，參與蝕損斑塊形成，進而參與ACS發病過程。NETs可與中性粒細胞釋放的顆粒蛋結合，從而在動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病中發揮重要作用。Wang等[13]研究表明活化的中性粒細胞形成NETs時期，中性粒細胞表達高水平PAD4。Franck等[14]研究發現，經佛波酯(一種抗生素)刺激中性粒細胞產生NETs，用含補體豐富的幼兔血清培養人冠狀動脈內皮細胞，用C5b-9染色法檢測細胞上補體沉積量。與單獨添加幼兔血清相比，添加NETs后，幼兔血清明顯增加了內皮細胞凋亡數。這一結果表明，NETs可能以依賴補體的方式促進內皮細胞死亡和脫離。同時，他們還發現血液被急性擾動后，PAD4的缺失或抑制NETs的形成可明顯保留內皮屏障功能，防止內皮損傷[15]。Stakos等[16]研究發現，在ST段抬高型急性心肌梗死患者的梗死相關冠狀動脈內，參與冠狀動脈血栓形成的組織因子的功能需要NETs結構的完整，暴露于NETs上的組織因子，能夠誘導凝血酶的產生，產生的凝血酶可以通過細胞蛋白酶活化受體進一步激活靜止的血小板，從而參與血栓形成。因此，PAD4和NETs可能破壞內皮的正常功能，從而成為預防和治療冠狀動脈粥樣硬化血栓并發癥的新靶點。

近年來研究表明，PAD4和依賴PAD4的NETs在人和小鼠動脈粥樣硬化形成中發揮重要作用[4]。巨噬細胞分泌細胞因子白細胞介素-1β是動脈粥樣硬化發病過程的主要驅動因子，NETs可啟動巨噬細胞釋放細胞因子，激活Th17細胞，促進動脈粥樣硬化斑塊中免疫細胞的合成。Liu等[17]研究發現，使用脫氧核糖核酸酶Ⅰ降解形成的NETs,這種方法降低了野生型小鼠體內NETs水平，與未處理的對照組小鼠相比，小鼠體內血管斑塊的大小明顯減少。Warnatsch等[18]研究證明了NETs參與動脈粥樣硬化的作用，他們將載脂蛋白E缺陷小鼠與缺乏中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的小鼠雜交以消除NETs,并給予高脂飲食，主動脈根部橫截面積分析顯示，兩組在高脂飲食治療4周后差異無統計學意義，但在高脂飲食治療8周后，載脂蛋白E/中性粒細胞彈性蛋白酶/蛋白酶3缺陷小鼠與僅缺乏載脂蛋白E的對照組小鼠相比，斑塊面積減少了75%。同樣，給予高脂飲食喂養的載脂蛋白E缺乏小鼠注射脫氧核糖核酸酶Ⅰ，小鼠的斑塊面積較前減少了75%。這些實驗結果表明，消除斑塊部位的NETs或阻止NETs形成可能對動脈粥樣硬化有預防或治療作用。Franck等[14]研究表明，造血細胞中的PAD4基因缺陷并不能影響動脈粥樣硬化早期病變脂紋的形成、減少斑塊大小或減少炎癥反應。他們將8周齡的Ldlr-/-小鼠接受致死性照射，與野生型或PAD4-/-小鼠骨髓重組，給予高脂飲食5或10周后，兩組小鼠血液膽固醇水平相似，兩組小鼠主動脈的脂質含量比較差異無統計學意義。此外，缺乏PAD4小鼠在高脂飲食5周或10周后，斑塊大小并沒有改變，也沒有改變巨噬細胞聚集。目前，PAD4的這一作用尚存爭議，仍需進一步的研究證明。

2.2PAD4在自身免疫性疾病中的作用 近年來，PAD4在多種自身免疫性疾病中得到廣泛研究，PAD4抑制劑被認為是治療自身免疫性疾病的新藥物。PAD4可通過促進NETs形成參與系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的發病過程[19-20]。PAD4參與中性粒細胞的特殊死亡過程，并形成特殊產物NETs，NETs中含有自身DNA-抗菌肽復合物，激活樹突狀細胞釋放干擾素，刺激自身B淋巴細胞釋放針對自身抗原的抗體，促進SLE患者體內炎癥反應和病情發展[21]。王增玲等[22]抽取SLE發病期與緩解期患者的靜脈血，并用特定試劑檢測血清PAD4水平。結果表明，PAD4在SLE患者緩解期和活動期均高表達，明顯高于正常對照組。同時，SLE患者腎組織中NETs高表達，浸潤的NETs可參與并加速患者腎臟損傷。PAD4在類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)中同樣發揮重要作用。有學者提出PAD4作為RA特異性較高的一種自身抗原，可作為類風濕因子和抗環瓜氨酸蛋白/肽陰性患者血清學候選診斷指標[23]。PAD4參與RA的發病過程主要是通過瓜氨酸發揮作用[24]。瓜氨酸化參與RA患者自身免疫反應、關節組織侵蝕破壞與血管翳形成。同時，RA患者的關節內分布著瓜氨酸蛋白的靶抗原，導致慢性疼痛和炎癥反應。PAD4過表達可引起RA患者滑膜液中PAD4 mRNA、PAD4蛋白和瓜氨酸肽的抗原變性而引起病理免疫反應[25]。呂卓等[26]選取確診RA的患者活動期24例，緩解期14例，并選取14例正常人作為對照，檢測各組靜脈血中的PAD4水平。結果顯示，RA患者活動期、緩解期PAD4表達水平均高于健康對照組，活動期較緩解期表達升高。Suzuki等[27]研究發現，與野生型的DBAⅠ小鼠相比，牛Ⅱ型膠原免疫PAD4基因敲除小鼠的炎癥細胞因子水平、臨床疾病評分和抗牛Ⅱ型膠原的抗體水平明顯降低，同時牛Ⅱ型膠原可以誘導小鼠體內PAD4的表達，因此，PAD4參與膠原誘導關節炎小鼠的發病過程。

同時，PAD4在多發性硬化癥(multiple sclerosis,MS)、抗中性粒細胞胞質抗體相關性小血管炎等其他自身免疫性疾病中同樣具有重要作用。在MS中，髓鞘堿性蛋白是維持髓鞘緊實和防止降解的關鍵蛋白，其含有非編碼氨基酸“瓜氨酸”的濃度和比例異常。PAD4通過催化蛋白質翻譯后的瓜氨酸，從而參與MS的發病過程。Wei等[28]選取患有自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型作為模型系統，模擬MS的炎癥狀態，分別每隔4天注射PAD4的抑制劑，第24天處死小鼠并對脊髓和腦組織進行抗CD3染色，結果在腦組織中治療組的CD3水平較未治療組顯著降低，腦組織中以CD3為主的T細胞明顯減少。這些研究表明，由于抑制了瓜氨酸的作用，經PAD4抑制劑治療后免疫應答減弱，PAD4酶抑制劑可以作為MS的靶向藥物。有研究發現[29]，抗中性粒細胞胞質抗體介導的中性粒細胞活化在體外可誘導NETs的形成，在NETs中存在一些靶向的自身抗原表位，如髓過氧化物酶和蛋白酶3。NETs可以沉積在抗中性粒細胞胞質抗體相關性血管炎患者發炎的腎臟中引起血管炎，促進自身對中性粒細胞成分的免疫反應。總之，PAD4在自身免疫性疾病發病過程中具有重要影響，PAD4酶抑制劑可能具有潛在的治療作用。

2.3PAD4在腫瘤中的作用 蛋白質瓜氨酸化不僅參與調控基因的表達，與炎癥、損傷、凋亡等機體病理生理過程有關，而且在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。PAD4在乳腺癌、直腸腺癌、食管腺癌及卵巢癌等多種腫瘤中高表達[5]。目前研究發現，抑癌基因p53在應激條件下可被激活，其編碼的p53蛋白可轉錄激活與細胞周期停滯、DNA修復和細胞凋亡有關的靶基因(如p21)。PAD4可抑制p53靶基因的表達，從而喪失其抑制腫瘤功能并且激活細胞生長存活通路。而PAD4抑制劑可引起p21表達增加，抑制腫瘤細胞增殖、誘發腫瘤細胞凋亡和周期停滯[30]。在腫瘤細胞中，PAD4可通過上調SESN2(一類抗氧化基因)的表達影響腫瘤細胞增殖和抑制腫瘤細胞生長[31]。PAD4可影響腫瘤細胞的凋亡。PAD4在多種非腺癌組織中與細胞角蛋白共表達，細胞角蛋白8、細胞角蛋白18和細胞角蛋白19可被PAD4瓜氨酸化，瓜氨酸化的細胞角蛋白可拮抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶介導的細胞骨架解聚過程，進而抑制腫瘤細胞凋亡[32]。同時，PAD4抑制劑氟脒或氯脒可對乳腺癌MCF7細胞、白血病HL-60細胞以及人結腸癌HT-29細胞等多種腫瘤細胞產生細胞毒性作用[33]。PAD4還可影響腫瘤細胞的轉移和侵蝕。腫瘤及微環境產生的白細胞介素-8在腫瘤細胞生長、侵襲和遷移中發揮重要作用，PAD4可使白細胞介素-8的第5位精氨酸轉變為瓜氨酸，瓜氨酸化的白細胞介素-8生物活性將明顯下降[34]。同時，晚期腫瘤患者血清中的PAD4可使抗凝血酶瓜氨酸化活性降低，從而使其喪失抑制腫瘤生長、轉移以及抗血管生成作用[35]。腫瘤相關性血栓形成同樣與PAD4相關，其形成通常伴隨有血漿組蛋白高瓜氨酸化。與腫瘤相關的血栓性微血管病患者血漿中的瓜氨酸化組蛋白水平較健康對照組明顯升高[36]。

同時，研究發現PAD4催化產生的NETs在多種惡性腫瘤中高表達，并且與治療效果及預后相關[37]。NETs內多種組分(如基質金屬蛋白酶-9、中性粒細胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G等)可以直接促進腫瘤細胞增殖、血管生成和遠處轉移[38-41]。NETs可錨定并包裹體內循環腫瘤細胞，從而逃避機體免疫系統對腫瘤細胞的攻擊。NETs及其代謝產物還能抑制機體免疫細胞功能[42]。NETs將體內循環腫瘤細胞與內皮細胞錨定，促進內皮細胞與腫瘤細胞的黏附，抑制NETs這種作用可顯著減少腫瘤細胞跨內皮滲出和遠處轉移[43]。NETs也可通過多種途徑參與腫瘤相關性血栓形成，循環中的NETs能夠為血小板黏附、聚集提供網狀支架，其組成成分(核DNA、組蛋白和蛋白酶)具有促凝活性。因此，PAD4抑制劑或降解NETs的藥物在腫瘤相關疾病中具有潛在的治療作用。

3 小 結

PAD4作為PAD家族中唯一具有核定位特性并作用于細胞核組蛋白的酶，是調節NETs產生必不可少的酶。PAD4首先在白血病中發揮作用而被發現，大量研究也表明PAD4在多種類型腫瘤中促進腫瘤細胞增殖、遠處轉移并參與腫瘤相關性血栓形成。隨著對PAD4研究的深入，研究發現PAD4在ACS、自身免疫性疾病中同樣具有重要作用。其可在ACS中促進內皮侵蝕、參與血管腔血栓形成和影響動脈粥樣硬化，通過直接作用或催化NETs形成，促進病理性免疫性反應形成，從而參與SLE、RA、MS等自身免疫性疾病的發病過程。目前對于PAD4的研究還處于起步階段，大部分研究為實驗性研究，關于PAD4的詳細作用機制及其促進NETs形成的具體途徑尚未完全明確，有待進行深入研究。PAD4在心血管疾病、腫瘤疾病的作用將是研究的熱點，PAD4可能成為開發新一代治療心血管疾病、腫瘤和自身免疫性疾病藥物的新靶酶。