大鼠脊髓挫傷模型對(duì)比及行為學(xué)評(píng)價(jià)

唐 濤，馬小翠，姚 冰，陳 一，樸浩哲*

(1.神經(jīng)外科，2.麻醉科；中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽 110042)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是一種高致殘率疾病，目前對(duì)其復(fù)雜的病理生理機(jī)制尚不完全清楚[1]。脊髓損傷動(dòng)物模型作為脊髓損傷研究的重要載體，作用至關(guān)重要。Allen AR在1911年創(chuàng)造了重物墜擊法制作脊髓損傷模型[2]。之后，隨著對(duì)動(dòng)物模型的要求逐漸提高，越來越多的造模方法被發(fā)明和改進(jìn)，其中脊髓挫傷模型更適用于繼發(fā)性脊髓損傷病理生理改的變研究。多中心動(dòng)物脊髓損傷模型(Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study, MASCIS)及無限視野模型(infinite horizon, IH)應(yīng)用廣泛、效果顯著，各有特點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)通過建立不同參數(shù)的MASCIS模型及IH模型，對(duì)這兩種模型進(jìn)行比較分析，并通過行為學(xué)及組織學(xué)對(duì)其評(píng)價(jià)，分析模型特征，為脊髓損傷研究動(dòng)物模型及參數(shù)選擇提供必要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用成年健康雌性SPF 級(jí)SD大鼠80只，體重250～300 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，[SCXK(軍)2012-0004]。隨機(jī)分為4 組(n=20)，分別為(1)NYU 12.5 mm組，(2)NYU 25 mm組，(3)IH 150組，(4)IH 200組。飼養(yǎng)于隔離屏障環(huán)境 [SYXK(軍)2012-0065]，每籠2只，12 h晝夜交替，室溫22℃～23℃，相對(duì)濕度40%～45%，可自由獲取食物及飲用水。實(shí)驗(yàn)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所完成，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備

大鼠稱重后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(0.6 mL/100 g)麻醉，以T10 棘突為中心備皮，俯臥位固定于手術(shù)操作板上。咬骨鉗咬除T9-11棘突及T10椎板，形成一個(gè)直徑約4 mm類圓形骨窗。將大鼠移至脊椎固定器固定，調(diào)整棘突夾使T10脊髓平面置于水平位置。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，NYU組應(yīng)用MASCIS打擊器，IH組應(yīng)用IH打擊器建立不同損傷程度的大鼠脊髓挫傷模型。NYU模型組設(shè)立打擊終速度(±2 s)為質(zhì)控范圍，IH模型設(shè)立形變量(±2 s)為質(zhì)控范圍。打擊后觀察到T10脊髓段充血，大鼠尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)，實(shí)際打擊數(shù)據(jù)未超質(zhì)控范圍認(rèn)定造模成功。術(shù)后大鼠滅菌飼養(yǎng)盒飼養(yǎng)，一周內(nèi)給予軟質(zhì)食物及溫水飼喂。每日3次膀胱按摩排尿護(hù)理至主動(dòng)排尿恢復(fù)。

1.2.2 BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分(Basso, Beattie & Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)

于術(shù)前2日建立BBB評(píng)分基線，術(shù)后3 d、1周、2周、3周、4周、6周及8周進(jìn)行雙側(cè)后肢BBB評(píng)分。評(píng)分由不清楚實(shí)驗(yàn)分組的工作人員實(shí)施[4]。

1.2.3 Grid Walking 評(píng)分(Grid Walking Test)

分別于術(shù)前2 d及術(shù)后4周和8周評(píng)價(jià)，將大鼠放置于架起的100×100 cm2格網(wǎng)上，單個(gè)網(wǎng)格大小為2×2 cm2，記錄其自由行走總步數(shù)(Steps)和后肢從網(wǎng)上掉落次數(shù)(Drops)，計(jì)算Drops/Steps比值。

1.2.4 熱痛

測(cè)試前將大鼠置于測(cè)試平臺(tái)上的有機(jī)玻璃箱內(nèi)，設(shè)置測(cè)試環(huán)境溫度為27℃，適應(yīng)15 min后開始測(cè)試。應(yīng)用熱輻射儀(SERIES 8 Model 390G IITC LifeScience，USA)對(duì)大鼠后肢足底中心進(jìn)行照射，通過反光鏡進(jìn)行監(jiān)測(cè)，記錄從開始照射到大鼠抬腳的反應(yīng)時(shí)間。5 min后重復(fù)檢測(cè)，總共重復(fù)測(cè)量6次，去掉最高值和最低值，計(jì)算其余4次的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，確定(±2 s)為正常范圍，如有測(cè)量值超出該范圍應(yīng)當(dāng)去除。如無異常值，該平均值作為該動(dòng)物正常熱痛閾值。

1.2.5 組織學(xué)觀察

于手術(shù)后8周將大鼠麻醉后多聚甲醛PBS緩沖溶液灌注，取T3至L4階段脊髓放置于多聚甲醛PBS緩沖液4℃過夜，經(jīng)30%蔗糖溶液脫水后，OCT包埋。恒冷切片機(jī)連續(xù)切片，片厚20 μm，冷貼片，選取損傷中心切片行HE染色，應(yīng)用ImageJ進(jìn)行灰度轉(zhuǎn)換，計(jì)算殘余脊髓組織面積、殘余組織面積占總橫斷面積的百分比[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 造模成功率比較

共造模動(dòng)物80只，脊髓打擊階段NYU組成功36例，成功率90%，IH組成功39例，成功率97.5%(表1)，行卡方檢驗(yàn)，P>0.05，兩組造模方法造模成功率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 脊髓損傷造模結(jié)果Table 1 Results of modeling of spinal cord injury

2.2 BBB評(píng)分結(jié)果

術(shù)前所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于適應(yīng)新的飼養(yǎng)環(huán)境后2天進(jìn)行baseline檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)異常動(dòng)物，得分均為21分。脊髓打擊造模后3天行BBB評(píng)分，所有動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度雙側(cè)后肢癱瘓，雖偶見體動(dòng)，但大部分評(píng)分還是接近于0分。術(shù)后1～2周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)分明顯上升，IH 150組、IH 200組以及NYU 12.5 mm組上升趨勢(shì)相似，明顯好于NYU 25 mm組(P<0.05)。4周后BBB評(píng)分上升進(jìn)入平臺(tái)期，上升趨勢(shì)減緩，IH 150組與NYU 12.5 mm組表現(xiàn)出較IH 200組明顯的恢復(fù)趨勢(shì)(P<0.01)。IH 150組與NYU 12.5 mm組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IH 200組低于IH 150組與NYU 12.5 mm組(P<0.001)，而高于NYU 25 mm組(P<0.001)。(圖1)

2.3 Grid Walking結(jié)果

損傷后第4周及第8周進(jìn)行Grid Walking 評(píng)價(jià)(圖2)，可見損傷后后足墜落率明顯升高(P<0.001)；第4周和第8周NYU 25 mm組均顯示出更高的失誤率(P<0.01)。

2.4 Hargreaves 結(jié)果

脊髓損傷后模型動(dòng)物足中心熱痛明顯，且有隨損傷加重?zé)嵬达@著的趨勢(shì)(P<0.05)，NYU 25 mm組結(jié)果顯示好于其它造模組，考慮因?yàn)樵摻M動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能尚未恢復(fù)至可自由運(yùn)動(dòng)的階段，掩蓋了實(shí)際結(jié)果。由于該評(píng)價(jià)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差較大，同時(shí)間點(diǎn)各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

2.5 組織學(xué)結(jié)果

定量分析脊髓損傷中心層面殘余組織面積及殘余組織面積/脊髓總橫斷面積比值(圖4，圖5)，損傷中心脊髓總橫斷面積隨損傷程度的增加而降低，NYU 25 mm組殘余組織面積最少，明顯低于其他研究組(P<0.001)；IH 150組與NYU 12.5 mm組損傷中心層面殘余組織無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在損傷中心處殘余組織面積占總橫斷面積的百分比與損傷程度的增加成反比(P<0.001)。

注： 損傷組與正常組相比墜落率明顯增高， P <0.001。第4周和第8周NYU 25 mm組與同時(shí)段其它損傷組相比，均顯示出更高的墜落率，P <0.01。圖2 各組Grid Walking行為學(xué)評(píng)價(jià)Note. The drop rate of the injury group was significantly higher than that of the normal group, P < 0.001. At the 4th and 8th weeks, the NYU 25 mm group showed a higher drop rate than the other injury groups at the same time, P < 0.01.Figure 2 Behavioral evaluation of grid walking in each group

3 討論

注：A.NYU 25 mm組損傷中心層面殘余組織面積明顯低于其它損傷組，P < 0.001；B. 損傷中心層面殘余組織面積與總橫截面積的比值與損傷程度的增加成反比，P < 0.001。圖4 定量分析脊髓損傷后損傷中心層面殘余組織Note. A. The residual tissue area at the injury epicenter of the NYU 25 mm group was significantly lower than that of the other study groups (P < 0.001). B. The ratio of the residual tissue area at the center to the total cross-sectional area was inversely proportional to the increase in the degree of injury (P < 0.001).Figure 4 Quantitative analysis of the residual tissue at the injury epicenter after spinal cord injury

脊髓挫傷模型是一種急性脊髓損傷模型，因其致傷過程與人類脊髓損傷過程高度相似，被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷性脊髓損傷病理生理機(jī)制研究中[6-7]。研究人員通過使用MASCIS及IH兩種不同的造模方法，建立4種不同損傷程度的大鼠脊髓損傷模型，造模成功率高，均達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。MASCIS打擊模型失敗原因主要為打擊速度未達(dá)到設(shè)計(jì)要求以及打擊偏離；IH打擊模型失敗原因?yàn)榻M織位移較小。BBB評(píng)分顯示，IH 150組、IH 200組以及NYU 12.5 mm組動(dòng)物均于損傷后4周恢復(fù)到12分以上，而NYU 25 mm組只達(dá)到(8.30±1.56)分，4周后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)進(jìn)入平臺(tái)期，提示IH 150 kdyn、IH 200 kdyn和NYU 12.5 mm損傷程度模型更易于后期觀察運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況，且由于Grid Walking和Hargreaves等行為學(xué)評(píng)價(jià)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BBB評(píng)分高于12分后結(jié)果更確切[8]，IH 150組、IH 200組以及NYU 12.5 mm組動(dòng)物在Grid Walking和Hargreaves評(píng)價(jià)中均表現(xiàn)出與其損傷程度相關(guān)的結(jié)果。通過對(duì)損傷后8周損傷中心脊髓組織殘余組織量及殘余組織面積占總橫斷面積的百分比的研究，證明損傷程度與中心脊髓組織殘余組織量及殘余組織面積占總橫斷面積的百分比相關(guān)。

注：各損傷組損傷后與損傷前比較足中心熱痛明顯，P <0.05；同一時(shí)間點(diǎn)個(gè)損傷組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P >0.05。圖3 各組Hargreaves行為學(xué)評(píng)分Note. After spinal cord injury, the foot center heat pain of the model rats was obvious, P <0.05; there was no statistical difference between the injury groups at the same time point, P >0.05.Figure 3 Hargreaves test behavior scores in each group

MASCIS打擊器與IH打擊器是目前應(yīng)用最廣泛、最成熟的商品化脊髓挫傷打擊器[3]，兩者均能方便的調(diào)整參數(shù)，從而控制損傷嚴(yán)重程度[9]，達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，但在實(shí)際工作中研究人員發(fā)現(xiàn)兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)。

注：A. IH 150組；B.NYU 12.5 mm組；C.IH 200組；D.NYU 25 mm組。圖5 損傷中心HE染色Note. A. IH 150 group；B.NYU 12.5 mm group；C.IH 200 group；D.NYU 25 mm group.Figure 5 Histological changes revealed at the spinal cord cross-sections taken at the epicenter of injury(HE staining)

MASCIS打擊器可以提供范圍更廣的損傷范圍，并能通過讀取的實(shí)際參數(shù)計(jì)算損傷力的大?。坏珜?shí)際操作中對(duì)于操作人員的要求較高，需要人工提起打擊桿，很難控制其對(duì)脊髓的壓迫時(shí)間[10]；打擊桿下落時(shí)易與套筒摩擦，導(dǎo)致實(shí)際速度未達(dá)到設(shè)計(jì)速度，損傷程度差異過大；打擊頭精度不高，容易偏離中心，導(dǎo)致雙側(cè)損傷不均一，甚至打擊到骨質(zhì)，造成造模失敗。

IH打擊器能夠很好的控制打擊力度，打擊部位精確，并能直接通過軟件觀察到組織位移程度及實(shí)際受力情況，易于進(jìn)行質(zhì)量控制，雙側(cè)損傷均一性高[11- 12]；但I(xiàn)H打擊器應(yīng)用電機(jī)控制，達(dá)到設(shè)置打擊力后瞬時(shí)收回，不能設(shè)置持續(xù)擠壓時(shí)間，不能完全模擬臨床脊髓損傷的病理生理改變；參數(shù)設(shè)置范圍較小，大鼠造模推薦參數(shù)范圍為100～200 kdyn，損傷程度差別較小，不易建立梯度損傷模型。

MASCIS和IH模型均能滿足脊髓損傷病理生理機(jī)制研究要求，為創(chuàng)傷性脊髓損傷提供有效的研究手段，因其本身特點(diǎn)存在部分差異，在應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x取適當(dāng)?shù)脑炷７绞郊霸炷?shù)，以利于揭示疾病本質(zhì)。