利用線蟲模型評價乳酸菌體內(nèi)抗氧化能力及其與體外抗氧化參數(shù)的對比

倪彩新，金星，周煒，陳曉華，印伯星，房東升，王剛*，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司，江蘇 揚州，225004)3(衡陽師范學院 生命科學與環(huán)境學院，湖南 衡陽，421008)

當機體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成過多或抗氧化防御系統(tǒng)能力降低時會造成機體內(nèi)活性氧的積累，引起氧化還原反應失衡，從而造成組織或細胞損傷，此被定義為氧化應激。氧化應激會引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)及碳水化合物等物質(zhì)損傷，也是導致癌癥、抑郁癥、糖尿病、帕金森病和心臟病等疾病的重要原因之一。機體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的能力有限，因此，尋找高效、安全的抗氧化膳食補充劑具有重要的意義。人工合成抗氧化劑(如BHA、BHT、TBHQ等)常被用作治療氧化應激的藥物，但長期服用帶來的對人體肝臟的危害及致癌性使人們對人工合成抗氧化劑的安全性充滿擔憂，因此找到合適的天然抗氧化劑勢在必行。目前研究表明，大多乳酸菌(Lactobacillus)屬于益生菌，其能安全食用且具有諸多益生性能[1]，如緩解乳糖不耐癥、改善胃腸道功能、提高免疫力及預防齲齒等，此外，許多體內(nèi)與體外的研究證明乳酸菌的細胞和無細胞提取物具有抗氧化活性[2]。因此開發(fā)乳酸菌作為天然抗氧化劑逐漸成為研究的熱點。

國內(nèi)外目前對乳酸菌體外的抗氧化能力的評價方法主要有活性氧自由基清除、還原能力、螯合金屬離子、抑制脂質(zhì)過氧化及抗氧化酶活性測定等[3-6]。這些化學方法操作簡單、快速、成本低，但沒有考慮到抗氧化劑在體內(nèi)的消化、吸收、代謝特性，不能反映其真正的生理活性[7]。動物模型實驗成本比較高、試驗周期長，不適合用于乳酸菌的大規(guī)模篩選，然而秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)模型卻是一種較好的替代方法[8]。秀麗隱桿線蟲是一種以細菌為食的生活在土壤中的微小生物體，由于其結構簡單，生命周期短,易于培養(yǎng)且遺傳背景清晰等優(yōu)點，已被廣泛用于生物學研究的實驗系統(tǒng)分析，是典型的壽命研究模型[9]。近年來，國內(nèi)外很多研究利用秀麗線蟲模型對乳酸菌[10-11]、植物及其提取物[12-16]等的抗氧化功效進行評價，相比于體外化學評價方法，能較好反映乳酸菌進入生物體內(nèi)的效果[11]。

本研究在體外抗氧化能力評價的基礎上，進一步采用秀麗隱桿線蟲過氧化氫氧化損傷模型對乳酸菌的抗氧化能力進行評價，篩選出具有高抗氧化能力的乳酸菌，同時考量體外抗氧化評價方法的可靠性與準確性。

1 材料與方法

1.1 菌株及蟲株

實驗用菌株及線蟲蟲株均來自于江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心。實驗所用24株乳酸菌菌株編號、種屬見表1，培養(yǎng)方式均為37 ℃、MRS培養(yǎng)基、有氧培養(yǎng)。秀麗隱桿線蟲為野生型，培養(yǎng)方式為20 ℃、NGM培養(yǎng)基(涂布E.coliOP50或乳酸菌)，大腸桿菌OP50(E.coliOP50)培養(yǎng)方式為37 ℃、LB培養(yǎng)基、200 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2 實驗試劑

MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH·)，美國Sigma-Aldrich公司；瓊脂粉、酵母粉，英國Oxoid公司；C12H8N2·H2O、H2O2、FeSO4·7H2O、Cl3CCOOH、FeCl3、K3[Fe(CN)6]、KH2PO4、L-半胱氨酸鹽(BR)等，國藥集團化學試劑有限公司。

表1 實驗所用24株乳酸菌Table 1 24 Lactobacillus strains used in the study

1.3 實驗儀器與設備

5415R小型臺式高速離心機，德國eppendorf公司；酶標儀，美國Thermo公司；GR60DA立式高壓蒸汽滅菌器，美國zealway公司；GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；starter3100pH計，美國Ohaus公司； C-MAG HS7熱力磁力攪拌器，德國Ika公司；ME3002E/02電子天平，上海METTLER TOLEDO儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳酸菌菌懸液制備

將保存于體積分數(shù)為30%的甘油保菌管(-80 ℃凍存)的乳酸菌以體積分數(shù)為2%的比例接種到MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化2次。取活化2次的乳酸菌培養(yǎng)液，6 000 r/min離心4 min，去除上清之后用PBS洗滌2次，用PBS調(diào)整乳酸菌菌懸液濃度為1×109CFU/mL，備用。

1.4.2 乳酸菌羥自由基清除能力的測定

參考張書文等[17]的方法略有修改，具體操作如下：分別取0.5 mL乳酸菌菌懸液，0.5 mL 2.5 mmol/L的1,10-菲羅啉，0.5 mL PBS(pH 7.4)，0.5 mL 2.5 mmol/L的FeSO4，混勻后加入0.5 mL 20 mmol/L H2O2，37 ℃中水浴90 min，在536 nm處測定其OD值。將0.5 mL乳酸菌菌懸液換成0.5 mL PBS為空白組；將0.5 mL的H2O2換成0.5 mL的蒸餾水為對照組。實驗重復3次。按照式(1)計算清除羥自由基的能力：

(1)

式中:A536(樣品)、A536(對照)及A536(空白)分別為樣品組、對照組及空白組在536 nm處測得的吸光值。

1.4.3 乳酸菌DPPH自由基清除能力的測定

乳酸菌菌體的DPPH自由基清除能力參考文獻[3]中的方法略修改，操作如下：取0.5 mL菌懸液與0.5 mL DPPH·(0.2 mmol/L，無水乙醇配制)，充分混勻后，室溫避光反應30 min，然后經(jīng)過6 000 r/min離心10 min。取上清液，517 nm處測定OD值。用等體積的PBS溶液代替樣品溶液作為對照組，并以等體積的PBS溶液和無水乙醇的混合液作為空白調(diào)零。實驗重復3次。按照式(2)計算DPPH自由基的清除率:

(2)

式中：A517(樣品)和A517(對照)分別為樣品組和對照組在517 nm處的吸光值。

1.4.4 乳酸菌還原能力的測定

參考LIN[18]和王英[19]的方法，取待測乳酸菌的菌懸液0.5 mL，10 g/L的鐵氰化鉀0.5 mL，0.5 mL PBS(pH 6.6)，混勻后放50 ℃水浴20 min。在冰浴中急速冷卻，加入0.5 mL 100 g/L的三氯乙酸，3 000 r/min離心10 min，取上清1 mL，再加入1 mL 1 g/L的FeCl3，10 min后在700 nm下測定OD值。將樣品換成蒸餾水作為對照組。實驗重復3次。結果采用L-半胱氨酸鹽標準溶液濃度表征還原能力。

1.4.5 線蟲培養(yǎng)與同步化

線蟲的培養(yǎng)使用NGM培養(yǎng)基，其上涂布有大腸桿菌OP50作為線蟲的食物，至少每周換1次培養(yǎng)皿。

選擇未污染、大多處于生殖期的線蟲培養(yǎng)皿，使用M9緩沖液將線蟲充分洗滌至離心管，1 300 g離心2 min，棄去上清。吸取350 μL線蟲懸液，之后每管加100 μL體積分數(shù)為5%的NaClO(現(xiàn)配現(xiàn)用)和50 μL 5 mol/L的NaOH溶液，充分混勻，觀察管內(nèi)線蟲的裂解狀態(tài)至所有成蟲蟲體裂解(少于10 min)。1 300×g離心2 min，輕輕吸去上清，立即加入M9緩沖液稀釋裂解液，混勻后，1 300×g離心2 min，重復上述步驟，反復洗滌2～3次，用M9緩沖液重懸，轉(zhuǎn)移至含大腸桿菌OP50的NGM固體培養(yǎng)皿中，20 ℃培養(yǎng)。

1.4.6 乳酸菌對氧化應激下秀麗線蟲的壽命影響

挑取同步化后培養(yǎng)至L4期的線蟲30～40條至含200 μL 1010CFU/mL的乳酸菌菌懸液的NGM培養(yǎng)皿上，20 ℃培養(yǎng)24 h后將線蟲成蟲轉(zhuǎn)移到新的含乳酸菌的NGM培養(yǎng)皿上，20 ℃培養(yǎng)24 h，備用。對照組的NGM培養(yǎng)皿內(nèi)的乳酸菌換為大腸桿菌OP50。

挑取各組線蟲成蟲約30條至預先加入0.5 mL M9緩沖液的12 孔板中，各孔加入0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.006%的過氧化氫溶液，20 ℃培養(yǎng)，每隔24 h觀察存活數(shù)，直至線蟲全部死亡。觀察時用挑蟲器一端輕輕觸碰蟲體，若無反應則認為線蟲已經(jīng)死亡。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Origin 8.5和GraphPad Prism 7.0對實驗數(shù)據(jù)分析作圖，利用SPSS 20.0的Bliss法計算半數(shù)致死時間(LT50值)。實驗結果采用“平均值±標準差”表示，顯著性差異分析采用SPSS 20.0的單因素方差分析(ANOVA)的Dunnett T3法進行分析，P<0.05則認為存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌羥自由基清除能力的比較

本研究在對乳酸菌體外抗氧化能力進行考察過程中以市場化的具有優(yōu)良抗氧化功效的鼠李糖乳桿菌LGG為參考進行研究。24株乳酸菌在相同條件下培養(yǎng)同樣的時間，經(jīng)過相同的處理，調(diào)整菌體濃度為109CFU/mL。利用芬頓反應產(chǎn)生羥基自由基，以1,10-菲羅啉-Fe2+作為指示劑對24株乳酸菌清除羥自由基的能力進行評價，24株乳酸菌羥自由基清除率結果如圖1所示。

圖1 24株乳酸菌的羥自由基清除能力
Fig.1 The scavenging effect of 24 strains on hydroxyl radicals
注：圖中標有不同字母的菌株有顯著性差異(P<0.05)。下同

由圖中數(shù)據(jù)可以得出，24 株乳酸菌的菌懸液均具有一定的羥自由基清除能力，清除率為(46.50±1.23)%～(84.84±2.07)%，有11株乳酸菌的羥自由基清除率高于LGG，植物乳桿菌Lp11有最高的羥自由基清除率，為(84.84±2.07)%。陳明等從青藏牦牛奶中篩選出8株對H2O2具有較強耐受能力的乳酸菌，而這8株乳酸菌菌體在1×109CFU/mL時羥自由基清除率范圍在18.22%～36.04%[20]，與本研究中的清除率相差較大，這可能是因為不同乳酸菌羥自由基清除率不同，同時不同的菌體處理方法也會造成羥自由基清除能力不同，乳酸菌處于不同的生長時期其羥自由基清除率也會有差異。

2.2 乳酸菌DPPH自由基清除能力的比較

1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)是一種以氮為中心的人工合成的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收，利用此特性可以很容易的檢測出抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力。盡管DPPH自由基并非是人體產(chǎn)生的自由基，但其清除能力仍能反映乳酸菌的體外抗氧化活性，24株乳酸菌的DPPH自由基清除率如圖2所示。

圖2 24株乳酸菌的DPPH自由基清除能力
Fig.2 The scavenging effect of 24 strains on DPPH free radicals

24株乳酸菌菌懸液均具有DPPH自由基清除能力，DPPH自由基清除率在(6.85±1.15)%～(41.80±1.57)%范圍內(nèi)，與LGG相比，有12株乳酸菌清除DPPH自由基的能力高于LGG，其中有5株乳酸菌的DPPH自由基清除率大于30%，分別是Lp6、Lf1、Lf3、Lf5、Lf7。王曦等對35株乳酸菌菌體、無細胞提取物、胞外分泌物的DPPH自由基清除能力進行了測定，發(fā)現(xiàn)乳酸菌的菌體DPPH自由基清除率均為零[21]，但李默等發(fā)現(xiàn)，30株乳酸菌菌株的菌體和胞內(nèi)無細胞提取物有相對較弱的清除能力，清除率為0～34.76%[22]，這可能是因為不同乳酸菌菌株起DPPH自由基清除作用的成分不同，本研究中乳酸菌菌體的DPPH自由基清除率在(6.85±1.15)%～(41.80±1.57)%，與李默等[22]的結果相近，說明研究中所用的乳酸菌菌株的菌體細胞均具有一定的DPPH自由基清除能力。

2.3 乳酸菌還原能力的比較

乳酸菌具有抗氧化活性表現(xiàn)為具有一定的還原活性，如還原Fe(III)的能力。本研究用鐵氰化鉀法測定24株乳酸菌的還原能力，并以L-半胱氨酸鹽當量表征其還原能力大小。各菌株的還原能力見圖3。

圖3 24株乳酸菌的還原能力
Fig.3 The reducing activities of 24 strains

各株乳酸菌均具有一定的還原能力，還原能力范圍在(21.05±9.02)～(92.99±2.27) μmol/LL-半胱氨酸鹽當量之間。除LGG外，植物乳桿菌Lp11、鼠李糖乳桿菌Lr1和Lr3的L-半胱氨酸鹽當量大于80 μmol/L，具有較強的還原能力。來自3個種的24株乳酸菌的還原能力存在明顯的種間和種內(nèi)差異，這可能與不同菌株菌體表面起抗氧化作用的物質(zhì)及其數(shù)量的差異有關。

2.4 乳酸菌對氧化應激下線蟲壽命的影響

有研究表明，乳酸菌具有延長線蟲壽命的功效[23-24]，不僅如此，乳酸菌還能在一定程度上保護線蟲免受外界所帶來的氧化損傷的困擾[10-11]。人們常常將氧化應激與長壽聯(lián)系在一起，自由基衰老理論更是指出氧化應激會引起衰老和與衰老相關的疾病，LARSEN的研究表明,增加線蟲的抗氧化應激反應可能是壽命延長的原因之一[25]，因此采用線蟲壽命作為緩解氧化應激的指標具有一定意義。在前面研究中，發(fā)現(xiàn)24株乳酸菌在體外均具有一定的抗氧化作用，進一步以氧化應激下線蟲的壽命為評價指標研究24株乳酸菌緩解線蟲氧化應激的效果。對喂食乳酸菌的線蟲進行過氧化氫刺激，引起線蟲氧化損傷，以喂食大腸桿菌OP50為陰性對照，喂食鼠李糖乳桿菌LGG為陽性對照，觀察線蟲壽命變化，以此分析乳酸菌對線蟲氧化應激的緩解作用。各組線蟲的壽命圖(過氧化氫刺激時記為0天0時)如圖4所示。

圖4 在H2O2引起的氧化應激下，乳酸菌對秀麗線蟲壽命的影響
Fig.4 The effect of lactobacilli on the lifespan ofC.elegansunder oxidative stress induced by H2O2
注：A、B、C為提前喂食植物乳桿菌的線蟲組；D、E為提前喂食發(fā)酵乳桿菌的線蟲組；F為提前喂食鼠李糖乳桿菌(含LGG)的線蟲組。

普通秀麗隱桿線蟲的平均壽命是14～21 d。減去過氧化氫刺激前約5 d的培養(yǎng)時間，由圖4可知，過氧化氫刺激使線蟲壽命顯著縮短，但喂食乳酸菌與喂食大腸桿菌OP50的線蟲壽命不同，且大多乳酸菌均對線蟲壽命有延長作用，這說明乳酸菌能夠有效緩解過氧化氫引起的氧化損傷，其中植物乳桿菌Lp11的緩解效果最明顯。以半數(shù)致死時間(LT50值)表征乳酸菌對緩解線蟲氧化損傷的作用，結果如表2所示。

表2 在H2O2引起的氧化應激下，喂食不同乳酸菌的線蟲的LT50值Table 2 The LT50 of C. elegans fed with different lactob-acilli under oxidative stress induced by H2O2

注：LT50值，是指在0.003%H2O2刺激下預先喂食不同乳酸菌或大腸桿菌OP50的線蟲死亡一半所需要的時間。

由表2 LT50值可以看出，有15株乳酸菌緩解線蟲氧化應激的效果好于鼠李糖乳桿菌LGG，其中植物乳桿菌Lp11的效果最好，LT50值達5.1 d。

2.5 乳酸菌體外抗氧化指標與線蟲壽命的相關性分析

由上述結果可以看出，植物乳桿菌Lp11具有最高的羥自由基清除率和較高的還原能力，但其DPPH自由基清除率卻不高，而喂食線蟲后能有效的緩解過氧化氫引起的氧化應激，且效果最好，3種體外抗氧化評價指標之間和它們與線蟲壽命實驗的結果存在一定的差異，而線蟲模型的結果較體外抗氧化方法能較好地反映乳酸菌進入體內(nèi)的抗氧化活性。因此為考量3種體外抗氧化評價方法是否能表征體內(nèi)抗氧化效果，進一步分別對3種化學方法與緩解線蟲氧化應激效果(LT50值)進行了擬合分析，如圖5所示。

利用Origin 8.5軟件分別對乳酸菌羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、還原能力與氧化應激下喂食乳酸菌的線蟲的LT50值進行擬合分析，結果顯示3種體外抗氧化化學評價指標與LT50值均具有顯著相關性(P<0.05)，說明這3種抗氧化活性評價方法能夠在一定程度上反映乳酸菌進入線蟲體內(nèi)的抗氧化效果。乳酸菌羥自由基清除能力與LT50值擬合R2=0.438 5，在P<0.01水平顯著相關，較另外2種方法相關性較強，能較好地反映乳酸菌在線蟲體內(nèi)的抗氧化能力，故認為羥自由基清除能力這一乳酸菌體外抗氧化測定方法更能準確反映目標物在生物體內(nèi)的抗氧化效果。

圖5 乳酸菌體外抗氧化指標與LT50值的相關性分析
Fig.5 The correlation analysis between antioxidant indexinvitroand LT50values ofC.elegans

3 結論

本研究使用了來自3個種屬(L.plantarum，L.rhamnosus和L.fermenti)的24株乳酸菌，通過羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、還原能力這3種化學方法對乳酸菌的體外抗氧化能力進行了評價和比較研究，進一步利用秀麗隱桿線蟲氧化損傷模型研究乳酸菌對線蟲氧化應激的緩解作用，并對體外抗氧化指標與線蟲LT50值進行相關性擬合分析。結果顯示，植物乳桿菌Lp11在體外和線蟲體內(nèi)均具有較高的抗氧化能力。相關性分析的結果顯示羥自由基清除能力這一體外抗氧化指標與緩解線蟲氧化應激的效果具有較強相關性(P<0.01)，能較好反映乳酸菌在線蟲體內(nèi)的抗氧化效果。本研究在體外化學抗氧化方法的基礎上，利用秀麗隱桿線蟲模型對乳酸菌的抗氧化能力評價，并考量體外抗氧化方法的可行性，但鑒于線蟲與哺乳動物的差距，仍需進一步使用動物模型如老鼠、兔子等對乳酸菌緩解氧化應激的效果進行評價。