天然產物分離純化新技術

王聰慧,任娜,魏微,趙卓,董巖

(北京聯合大學 生物化學工程學院 食品科學與工程系,北京 100023)

天然產物是指從植物、動物體內提取的內源性的化學成分,包括黃酮類、有機酸類、酚類、蛋白質等對人體具有多種功效[1]。如花青素能夠延緩衰老[2],綠原酸具有促進炎癥愈合作用[3],白藜蘆醇對人體心血管具有一定的保護作用[4]等,因此人們對天然產物的需求日益增長。但是由于天然產物含量較低、結構復雜、穩定性差等特點[5],它的分離純化有一定的困難性。目前,常用的分離純化方法主要有膜分離、吸附法、高速逆流色譜法等方法,本文綜述了這幾種方法在分離純化天然產物中的應用。

1 膜分離

膜分離技術是一種物理分離過程,適合在常溫下操作,所需能量低,產生廢水少,分離過程簡單高效,因此,它是分離熱敏性物質的一種有效的方法,而很多天然產物都對溫度敏感,故膜分離也應用于天然產物的分離純化中。

Fadi Ali等[6]將電酸化分別和超濾/透濾(UF/DF)(pH=6)、UF/DF(pH=9)及等電沉淀法(pH=4.5)相結合制備大豆蛋白(SPI),并對制成的大豆提取物的組成和溶解度進行了比較,研究不同pH值的影響。結果表明,在pH=6時采用UF/DF,能夠更有效地除去大豆蛋白中的礦物質,且大豆蛋白的溶解度與pH=4.5和pH=9時相比,分別提高了25%和60%。在pH為2～4.5之間,大豆蛋白的溶解度提高,而果汁等飲品的pH值恰好在3.5左右,因此,該提取物可作為果汁飲料或動力果汁配方的一種有價值的成分。

Zhao等[7]以玉米糠為原料,利用膜分離從它的生物堿水解物中分離阿魏酸。結果表明,在75 ℃時,將玉米糠在0.25%的氫氧化鈉乙醇水溶液中溶解2 h,能夠釋放出81%的阿魏酸。溶解之后先超濾再納濾,納濾后直接結晶,可以很容易地將阿魏酸分離純化出來。這種阿魏酸的分離技術要比離子交換層析簡單得多,且產生的廢水和有機溶劑較少。

Mei Yuh Chung等[8]通過超濾提取紫蘇中的花青素。主要是通過分析膜分離過程中的溶質截留率和滲透通量,研究膜在截留花青素的同時能否讓檸檬酸通過。采用10%檸檬酸溶液從紫蘇葉中提取花青素,萃取物中的花青素可以通過超濾(UF)濃縮,超濾所用的膜截留量為6 000,這可能是由于形成了絡合物。在UF操作中,增加跨膜壓力或增加進料濃度導致溶質截留率增加,UF對花青素的回收率達到60%以上。

2 吸附法

吸附法主要利用具有吸附性能的材料對目的產物進行吸附,再使用其它試劑將其洗脫,從而得到純度較高的分離物,是一種常用的分離方法。吸附法具有很多優點[9],如操作簡單、高效節能,并且大多數情況吸附劑可再生循環利用等。到目前為止,常見的吸附劑有大孔樹脂、分子印跡、炭材料、PVPP、介孔二氧化硅等。

2.1 大孔樹脂

大孔樹脂是一種聚合物,具有選擇性良好、平均孔徑大和機械強度高等特點,并且經濟、環保、易于再生。因此,大孔樹脂作為一種吸附劑在學術界的應用已非常普遍。

Sun等[10]利用大孔樹脂ADS-21從向日葵的葉子中分離純化綠原酸(3-CQA)。結果表明,ADS-21能夠很好的吸附/解吸3-CQA。在25 ℃時,使用ADS-21樹脂對3-CQA的吸附過程很好地符合Langmuir等溫吸附和準二級動力學模型。利用ADS-21進行吸附后,產物中3-CQA的含量增加了5.42倍,從12.0%增加到65.2%,回收率為89.4%。

Liu等[11]對比研究了24種不同類型的大孔樹脂對番茄皮中的番茄紅素的吸附性能。結果顯示,相比其它樹脂,LX-68樹脂具有更高的分離效率。LX-68樹脂對番茄紅素的靜態吸附實驗符合Langmuir等溫吸附和準二階動力學方程。將LX-68樹脂對番茄紅素的動態吸附/解吸實驗進行優化,得到最佳分離條件如下：45 ℃時,采用樣品濃度、體積和流速分別為16.3 mg/L、500 mL和20 BV/h；洗脫時,先采用100 mL 95%的乙醇,之后用100 mL乙酯-乙醇(30∶70,v/v),當流速達到20 BV/h時,換為100 mL流速為30 BV/h的乙酯-乙醇(70∶30,v/v),溫度與吸附過程相同。經過動態分離純化,得到的番茄紅素含量增加了30.4倍,從0.21%增加到6.38%,回收率為66.9%。

2.2 分子印跡技術

分子印跡聚合物是一種對目的物能夠進行特異性選擇識別的物質。由于這些聚合物材料在設計分子選擇性、耐久性和可再生性等方面具有優勢,在科學界引起了越來越多的關注。

Lachlan J Schwarz等[4]采用分子印跡固相萃取(MISPE)技術從花生壓榨廢液中分離(E)-白藜蘆醇。結果顯示,印跡分子MIPres對溶解在有機溶劑中的(E)-白藜蘆醇具有較好的吸附能力,且能在水溶液中條件下清除花生壓榨廢液中的其他成分。因此,只需少量樣品,MIPres就能夠從含有生物活性多酚(包括(E)-白藜蘆醇和兒茶素)的花生壓榨廢液中有效地提取(E)-白藜蘆醇。

段玉清等[12]通過制備白藜蘆醇納米二氧化硅表面分子印跡聚合物(MIPs-Res)對白藜蘆醇進行吸附。結果顯示,與化學組成相同的非印跡聚合物相比,MIPs-Res對白藜蘆醇的選擇性和吸附性更高,最大吸附量為11.20 mg/g,能夠在3 h內達到吸附平衡。

2.3 多孔炭材料

常見的多孔炭材料主要有活性炭、碳納米管、中孔炭等。

2.3.1 活性炭 活性炭具有多孔結構,比表面積大,能夠吸附分子化合物,因此,它在食品工業及制造業中經常作為一種吸附劑來使用。

Ou等[13]研究了粉末活性炭和顆粒活性炭分離純化阿魏酸的區別,結果表明,在極低濃度下,粉末活性炭能夠更有效地吸附阿魏酸并進行回收,且用0.2 mol/L的NaOH溶液能夠將吸附的阿魏酸完全洗脫。因此,在甘蔗渣的堿水解產物中,即使阿魏酸濃度較低,也可用粉末活性炭對阿魏酸進行回收。

Mirna Leonor’Sua rez-Quiroz等[14]用80 ℃熱水、70%甲醇溶液(v/v)和60%異丙醇溶液(v/v)3種試劑提取綠原酸,并結合活性炭純化方法進行分離試驗。結果表明,使用80 ℃水提取結合活性炭進行純化,產生的污染小,且提取率高(5.07±1.0)%,與有機溶劑提取和活性炭純化的結果相比,兩者無顯著差異。但是,使用熱水不僅能夠有效避免有機溶劑所產生的污染,并且更加省時省力,因此,可以用熱水代替有機溶劑。

2.3.2 碳納米管 碳納米管是一種新型炭材料,物理化學性質穩定、孔隙結構多、比表面積較大,因此常用來作為吸附藥物、染料大分子、農藥等的吸附劑。Niu等[15]研究了碳納米管固相萃取三組高極性化合物(即頭孢菌素類抗生素、磺胺類藥物和酚類化合物)的能力。結果表明,對于高極性化合物,碳納米管的提取效果明顯優于C18。將碳納米管和石墨化碳黑的吸附能力對比,發現前者對于頭孢菌素類抗生素和磺胺類藥物的吸附能力更強,但后者對一些酚類化合物的吸附能力更高。使用碳納米管在最優條件下對樣品進行回收,其中,磺胺噻唑和磺胺嘧啶的回收率分別在55%～79%和72%～92%,磺胺吡啶和磺胺嘧啶的回收率均在85%～102%。

2.3.3 中孔炭 中孔炭除了具有炭材料的一般優點外,還具有孔徑較大、中孔孔容較大等優點,廣泛地被應用于分離純化等。

張川等[16]采用廉價的水玻璃為原料來制備中孔炭,之后對制備的中孔炭吸附性能進行研究。結果表明,制成的中孔炭微球的平衡吸附量遠超一般的吸附材料,能夠達到606 mg/g。在研究中孔炭微球的孔徑和孔容對VB12吸附的影響時發現,當孔徑逐漸減小或孔容逐步增大時,平衡吸附量增大；但溫度對VB12吸附的影響則呈現鐘形,即隨著吸附溫度逐漸升高,平衡吸附量先增加后減小。中孔炭微球對VB12的吸附吻合Langmuir等溫吸附和準二級動力學模型。

我們實驗室的孫慧等[17]利用中孔炭純化葡萄葉中提取的白藜蘆醇。結果發現,在50 ℃條件下,用40%乙醇萃取30 min,可得到最大白藜蘆醇含量。純化時,先用中孔炭進行吸附,再用70%乙醇洗脫,得到的白藜蘆醇純度從2.1%提高到20.6%,且雜質含量最低,抗氧化活性最高。

2.4 PVPP

PVPP,全稱交聯聚乙烯吡咯烷酮,也是一種吸附材料。

LenaJankowiak等[18]研究了pH值在4～7的情況下,PVPP對豆渣提取物中異黃酮的吸附。結果表明,通常情況下,PVPP對于大豆異黃酮的親和力要比對甘油三酯的親和力高出10倍左右,但隨著pH值的降低,PVPP對甘油三酯的親和力略有提高,但大豆異黃酮并無顯著性變化。而PVPP在中性pH時對異黃酮的親和力最高。由于部分異黃酮與蛋白質相結合,提取物中含有大量的蛋白質,在pH較低的情況下,蛋白質會發生沉淀導致異黃酮的損失,故沒有使用PVPP的情況下,約有3%～25%的蛋白質會損失。因此,利用PVPP進行吸附的時候,不同pH條件下會影響對產物的吸附性能會有影響,故需注意控制pH值。

Couteau D等[19]對酶解后的甜菜渣中的阿魏酸進行分離純化。結果表明,顆粒活性炭(GAC)、XAD-16和PVPP在動態吸附時對阿魏酸的最大吸附量(w∶w阿魏酸/吸附劑)分別為22%,12%和8%。實驗時發現,洗脫液的pH值是決定吸附效率的關鍵因素。在相同pH值條件下,顆粒活性炭對阿魏酸的親和力最高,其次是XAD-16和PVPP。

2.5 介孔二氧化硅

介孔二氧化硅是一種多孔材料。

Yoshiumi Kohno等[20]研究了天然花青素染料在介孔二氧化硅上的吸附,以及吸附后花青素的穩定性。結果表明,含微量鋁的HMS型介孔氧化硅可以成功吸附花青素,利用正丙基對二氧化硅疏水表面進行改性,提高了吸附在孔中的花青素的含量和穩定性。

2.6 殼聚糖微球

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素,是一種天然多糖,不僅具有良好的降解性能,且能夠抑制細菌生長,還具有來源豐富、價格低廉、環保等優點,可作為生物吸附劑,通過氫鍵或離子交換相互作用吸附各種有機酸。

Liu等[21]研究了以殼聚糖微球為吸附劑,分離經泡沫分離和酸性水解后產生的大豆乳清廢水中的異黃酮苷元。結果表明,異黃酮苷元在殼聚糖微球上的吸附是一個自發放熱的物理過程,符合準二階模型,吸附等溫線適合用Freundlich方程來描述。在pH=6時可以獲得最大的平衡吸附容量。以70%乙醇為解吸溶液,總異黃酮苷元最大解吸率可達94.82%。此外,再生的殼聚糖微球可以重復使用,在不影響其功能的情況下,可連續使用5次。

3 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法(HSCCC)與傳統的色譜分析有一定的區別,但由于分離時間短,能夠有效避免因發生化學反應而使產物變性的優勢。

Yang等[22]分別采用氯仿甲醇水溶液、氯仿甲醇正丁醇水溶液和甲基叔丁醚-四氫呋喃-0.5%三氟乙酸水溶液從大豆粗提物中分離異黃酮。結果表明,各分離組分的純度均達到98%～99%。利用氯仿甲醇正丁醇水溶液提取的大豆粗提物500 mg,經高效液相色譜法分離,得到約100 mg的大豆苷,純度超過98.5%；得到4種極性異黃酮5～10 mg,純度在98%～99%之間。由此可見,高速逆流色譜法是一種高效的分離純化方法,可應用于大分子分離等。但是采用此種方法分離成本較高,且只適用于少量產物的分離,因此該方法的應用并不廣泛。

4 結束語

本文綜述了膜分離、吸附法(大孔樹脂、分子印跡、炭材料等)、高速逆流色譜等方法對天然產物的分離純化。其中,膜分離是一種新興的技術,最初是應用在大分子活性物質的分離中,但是已有研究者慢慢將其應用到小分子物質的分離純化中；大孔樹脂是一種常見的吸附材料,因其容易獲得、成本低、選擇性較好等優點,常被用來分離活性物質等,但分離過程中可能存在有機溶劑污染、產生大量的廢液等缺點；炭材料也是一種常用的分離方法,由于其具有很高的比表面積、孔隙較大,從而能夠通過吸附對天然產物進行分離純化,與此分離機理類似的還有介孔二氧化硅、PVPP、殼聚糖等；高速逆流色譜是一種色譜方法,能夠減少產物與空氣的接觸時間,分離純度較高,但是分離量不夠大、成本高。

因此,在未來對天然產物的分離純化中,若是能夠處理好成本、環保、分離性能之間的關系,且能夠大規模進行分離純化,以上天然產物的分離純化方法將具有開拓性的進展。